大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌蛋白表達(dá)原理

誘導(dǎo)原理：Lac 阻遏物是一種具有 4 個(gè)相同亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個(gè)與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點(diǎn)。在沒有乳糖存在時(shí)，lac 操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac 阻遏物能與操縱基因 O 結(jié)合，阻礙 RNA 聚合酶與 P 序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合后，其蛋白構(gòu)象就發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因 O 上解離下來，RNA 聚合酶不再受阻礙，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
 

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)步驟

不包括基因構(gòu)建等上游操作和蛋白純化部分?；驑?gòu)建參考密碼子優(yōu)化，蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內(nèi)容主      要包括蛋白表達(dá)鑒定：

1.表達(dá)鑒定第一天的任務(wù)，常用抗性選擇根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞選擇

• 拿到質(zhì)粒，離心（3000r/min；2min）

• 在質(zhì)粒中加入 TE（使質(zhì)粒最終加入到 110μL 感受態(tài)細(xì)胞中的量為 80-100ng，據(jù)此確定加入 TE 的量

• 一般為（1μg 質(zhì)粒加 20μLTE；2μg 質(zhì)粒加 50μLTE；5μg 質(zhì)粒加 100μL TE）

• 將質(zhì)粒與 TE 混勻，加入 2μL 混液于感受態(tài)細(xì)胞中

• 將感受態(tài)細(xì)胞放入冰箱（4℃）中，30min

• 取出后立即放入水浴鍋中（42℃），熱激 90s，

• 再次放入冰箱（4℃）中，3min

• 拿出后取 200μL 的 LB 液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中

• 放入搖床（37℃； 195r） 中， 30nim 至 60min； （最佳 45min）

• 取出離心（3000r/min；2min）

• 去掉 200μL 的上清，留 100μL 左右上清懸浮沉淀，吸取 50μL 懸液涂平板，（先將對應(yīng)抗性的平板放入培養(yǎng)箱（37℃）中預(yù)熱 20min）

• 把平板放入培養(yǎng)箱（37℃），過夜（12h 至 16h）

2.表達(dá)鑒定第二天的任務(wù)，注意 Pcold 的表達(dá)溫度

• 每個(gè)平板挑取單菌落至 4 支對應(yīng)抗性的 LB（4ml）試管中，編號(hào)為“0”“1”“2”“3”

• 將試管放入搖床（37℃；195r） 中，（單抗 3h 左右；雙抗 4 左右；剛開始用可見分光光度計(jì)測 OD 值； 熟練后可目測（背光下，以試管中的槍頭為例，剛剛看不見槍頭即可）），測 OD 值（0.6 至 0.8）

• 從“0”號(hào)管中取 700μL 懸液加入到 100μL（C=80%）的保種甘油中，震勻，放入冰箱（-20℃）凍存

• 在每組菌的“1”“2”“3”號(hào)試管中分別加入 2μL 的 IPTG（終濃度 0.5mM 最適）

• 視不同的載體選擇適合的表達(dá)環(huán)境（PET/PGEX：15℃表達(dá)過夜；25℃表達(dá) 6h；37℃表達(dá) 3h 至 4h（4 支試管，“0”“1”號(hào)試管 15℃表達(dá)過夜；“2”“3”試管 37℃表達(dá) 3h 至 4h）。Pcold：全部 15℃表達(dá)過夜）

3.表達(dá)鑒定第三天，全菌的表達(dá)鑒定分析，注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度

• 從每組 4 支的試管中均取 500μL 菌液加入到 1.5ml 離心管中，（若 OD 值不一樣，值小的可多取）離心

• （6000r/min），5min， 去上清，留沉淀（沉淀少的，可再取菌液離心，盡量使沉淀量接近）

• 在每個(gè)離心管中加入 500μL 的 DDH2O，懸浮沉淀，離心（6000r/min），5min， 去上清，留沉淀

• 在每支離心管中加入 45μL 的 1×PBS 和 45μL 的 2×Loading Buffer 懸浮沉淀（當(dāng)溶質(zhì)適量且均一的情況下，加入量不變；當(dāng)溶質(zhì)多且粘稠時(shí)，應(yīng)使加入量增大，為降低粘度也可減少上液量）

• 放入煮樣器（100℃） 25min

• 取出后離心（6000r/min） 3min， 電泳檢測。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

• 質(zhì)粒載體：小型環(huán)狀 DNA，能自我復(fù)制。一個(gè)完整的質(zhì)粒載體必須要有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、插入的目的基因、篩選標(biāo)記以及終止子；此外對大腸桿菌表達(dá)載體的要求是：①操縱子以及相應(yīng)的的調(diào)控序列，外源基因產(chǎn)物可能會(huì)對大腸桿菌有毒害作用；②SD 序列，即核糖體識(shí)別序列，一般 SD 序列與起始密碼子之間間隔 7-13bp 翻譯效率最高；③多克隆位點(diǎn)以便目的基因插入到適合位置。

• 目的基因：在大腸桿菌表達(dá)體系中要表達(dá)的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因；原核基因可以在大腸桿菌中直接表達(dá)出來，但是真核基因韓有內(nèi)含子不能，大腸桿菌不能對 mRNA 進(jìn)行剪切，從而形成成熟的 mRNA，所以真核基因一般以 cDNA 的形式在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。此外還需提供大腸桿菌能識(shí)別的且能轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因的元件。

• 表達(dá)宿主菌：表達(dá)蛋白的生物體即大腸桿菌。表達(dá)宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達(dá)過程中是很重要的因素——多數(shù)人會(huì)直接選擇實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用過的宿主菌，而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據(jù)宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性，例如目的蛋白需要形成二硫鍵，可以選擇 Origami 2 系列，Origami 能顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)；目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta 2 系列，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA 及 CGG）稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。

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• 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)種類

• T7 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

以 T7 啟動(dòng)子、T7RNA 聚合酶等 T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系的元件為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。T7 RNA 聚合酶一種高活性的RNA 聚合酶，mRNA 的合成速度比大腸桿菌內(nèi)的 RNA 聚合酶快 5 倍，并某些不能被大腸桿菌 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄的序列也可以轉(zhuǎn)錄，所以 T7 RNA 聚合酶和 T7 噬箘體啟動(dòng)子的存在的情況下，大腸桿菌本身的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7 噬箘體啟動(dòng)子控制基因的轉(zhuǎn)錄。

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• Lac 和 Tac 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

它是以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具有多順反子結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)排列為：

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• 啟動(dòng)子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）
  原理：在無誘導(dǎo)物的情況下，負(fù)調(diào)節(jié)因子 lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。加入誘導(dǎo)劑后，IPTG 與 lacI 基因產(chǎn)物結(jié)合，使操縱基因解離出來，lac 操縱子的轉(zhuǎn)錄因此被激活。用 tac 啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為 Tac 表達(dá)系統(tǒng)。
   

• PL 和 PR 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

以啟動(dòng)子 PL、PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力，誘導(dǎo)時(shí)不需要加入化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本低廉，但在熱刺激過程中，大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會(huì)被激活，降解所表達(dá)的外源蛋白；其次是在      大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，通過熱平衡交換方式提高溫度，需要較長的時(shí)間，這會(huì)降低誘導(dǎo)效果，從而對重組蛋白的表達(dá)量有影響。

此外還有其他表達(dá)系統(tǒng)，如 pH 調(diào)控型、營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型等。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)比較

大腸桿菌與其他表達(dá)系統(tǒng)比較