97国产精品成人免费视频_国产精品高颜值极品美女在线_少妇自拍中文亚洲_黄情网站日本免费在线_一级黄色成人在线_欧美亚洲高清国产_亚洲人妻综合av一区_欧美日韩色视频一区二区看_91视频免费版下载_丰满少妇蜜桃av

噬菌體展示技術(shù)(phage display technology)的本質(zhì)是一種篩選技術(shù)。將不同的外源基因分別插入噬菌體載體中， 隨著噬菌體的傳代，外源蛋白會展現(xiàn)在噬菌體表面，形成噬菌體文庫。隨后用特定蛋白對噬菌體文庫進(jìn)行篩選，便可快速的得到與該蛋白具有高度親和力的抗體。篩選出的抗體可以進(jìn)一步用于生物學(xué)功能研究。

噬菌體展示技術(shù)原理
噬菌體展示技術(shù)的原理，是將一段外源基因插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正常且不影響外      殼蛋白正常功能的情況下，外源基因會隨著外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，從而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展現(xiàn)在噬菌體表面。

圖 1.噬菌體展示原理

     被展示的蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于靶蛋白的結(jié)合，因而可以利用靶蛋白快速的進(jìn)行噬      菌體展示文庫的篩選。在展示文庫構(gòu)建完成后，以靶蛋白為固定相，和展示文庫共同孵育一段時(shí)間，洗去未結(jié)合噬      菌體，再以競爭受體洗脫吸附的噬菌體。洗脫得到的噬菌體感染宿主菌繁殖擴(kuò)增，然后進(jìn)行下一輪洗脫。經(jīng)過 3~5 輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后（對于某些親和力弱的抗體需經(jīng)過更多輪的洗脫），便可以得到能與靶蛋白特異性結(jié)合      的噬菌體的高度富集。

圖 2. 生物淘洗法篩選噬菌體展示文庫

       篩選得到的高度親和力的噬菌體集合中可能含有多個(gè)克隆，可以利用 ELISA 或 Westen Blot 進(jìn)一步對得到的外源蛋白進(jìn)行篩選，或?qū)Φ鞍走M(jìn)行鋪盤分離單克隆菌株，從而得到特異性的單克隆抗體，進(jìn)而進(jìn)行生物學(xué)方面研究。
噬菌體展示技術(shù)與其他抗體制備方法對比

表 1.不同抗體制備方法比較

噬菌體展示系統(tǒng)
單鏈絲狀噬菌體（M13）展示系統(tǒng)

絲狀噬菌體是一種能夠感染陰性細(xì)菌的病毒大家族。他們都含有單鏈 DNA 基因組，其衣殼蛋白為管狀，通常由幾千個(gè)拷貝的主要衣殼蛋白（PⅧ）和位于尾端的次要衣殼蛋白（PⅢ）組成。

圖 3. 絲狀噬菌體結(jié)構(gòu)

      PⅢ展示系統(tǒng)：PⅢ是絲狀噬菌體的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個(gè)      病毒顆粒都有 3 個(gè)～5 個(gè)拷貝 PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為 N1、N2 和 CT 3 個(gè)功能區(qū)域，這 3 個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽 G1 和 G2 連接。其中 N1 作用于 E.coli 細(xì)胞膜上的 TolA 蛋白，與噬菌體入侵有關(guān)；N2 為受體結(jié)合區(qū)，負(fù)責(zé)結(jié)合 F 菌毛；CT 疏水區(qū)在組裝前粘附在細(xì)菌內(nèi)膜上，與噬菌體組裝中止有關(guān)。PⅢ有 2 個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于 PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和 N1 之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的 PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與 PⅢ蛋白的 CT 結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整 PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。

圖 2. PⅢ蛋白結(jié)構(gòu)域及其功能

        PⅧ展示系統(tǒng)：PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C 端與 DNA 結(jié)合，N 端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有 2700 個(gè)左右 PⅧ拷貝。PⅧ的 N 端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型 PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)， 此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。
表 2. PⅢ展示系統(tǒng)與 PⅧ展示系統(tǒng)比較

λ噬菌體展示系統(tǒng)
PV 展示系統(tǒng)：λ噬菌體的 PV 蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分，該管狀結(jié)構(gòu)由 32 個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤又由 6 個(gè)PV 亞基組成。PV 有兩個(gè)折疊區(qū)域，C 端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均 1 個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。
D 蛋白展示系統(tǒng)：D 蛋白的分子質(zhì)量為 11 ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D 蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的 82%時(shí)，可以在缺少 D 蛋白的情況下完成組裝，故 D 蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內(nèi)也可以在體外，體外組裝即是將 D 融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含 D 融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補(bǔ)償溶源菌所缺的 D 蛋白，通過熱誘導(dǎo)而組裝。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn)， 噬菌體上融合蛋白和 D 蛋白的比例可以由宿主的抑制 tRNA 活性加以控制，這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。

T4 噬菌體展示系統(tǒng)
T4 噬菌體展示系統(tǒng)的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與 T4 衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9 ku）和 HOC（40 ku）融合而直接展示于 T4 噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化， 避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4 噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。同時(shí)，SOC 與 HOC 蛋白的存在與否，并不影響 T4 的生存和繁殖。SOC 和HOC 在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于 DNA 的包裝而裝配于衣殼的表面，事實(shí)上，在 DNA 包裝被抑制時(shí)，T4 是雙股 DNA 噬菌體中唯一能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC 和 HOC 也同時(shí)組裝）。因此，在用重組 T4 做疫苗時(shí)，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏 DNA 的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。

T7 噬菌體展示系統(tǒng)
T7 噬菌體是 20 世紀(jì) 90 年代末期建立的一種新型噬菌體展示技術(shù)。T7 噬菌體是一種含有雙鏈絲狀 DNA 的烈性噬菌體，其衣殼蛋白一般又 10A 和 10B 兩種形式。外源基因插入的位置一般位于 10B 蛋白的 C 端，這樣好處有兩點(diǎn)， 一方面 C 端結(jié)合空間位阻??；另外一方面，C 端的蛋白較晚被翻譯，即使是外源蛋白質(zhì)的編碼基因中含有終止密碼子，也不影響與其 N 端融合的 10B 蛋白的完整表達(dá)。與 M13 系統(tǒng)相比，T7 噬菌體直接使宿主菌進(jìn)行裂解，因而不需經(jīng)過分泌過程。因此，對于那些對分泌過程有抑制作用的蛋白和多肽，在 M13 系統(tǒng)不能很好的展示，但是可以在 T7 系統(tǒng)中展示。除此之外，T7 噬菌體優(yōu)勢有：

• 生產(chǎn)非常迅速，在固體培養(yǎng)基上形成噬菌體只需 3h，在菌液中從感染到裂解只需 1~2h，可以節(jié)省大量的時(shí)間； 對于>50 個(gè)氨基酸的多肽，T7 噬菌體可以在不需要輔助噬菌體的情況下進(jìn)行包裝。

• 可高拷貝數(shù)展示約 50 個(gè)氨基酸的多肽片段（450/噬菌體），可中拷貝數(shù)展示 900~1200 個(gè)多肽片段（5~15/ 噬菌體），可低拷貝數(shù)展示 900~1200 個(gè)氨基酸的多肽片段（0.1~1/噬菌體）

• T7 噬菌體在高 PH 值、高鹽、變性劑（100 mmol/L DTT）等條件下十分穩(wěn)定，可根據(jù)不同需要采用多種條件進(jìn)行篩選，并能在篩選后仍然保持很高的篩選活性。

噬菌體展示應(yīng)用
       噬菌體展示技術(shù)擁有諸多優(yōu)勢，它實(shí)現(xiàn)了蛋白/多肽基因型與表型的統(tǒng)一，在蛋白質(zhì)與其遺傳基因之間建立了直接的物理聯(lián)系；可以快速的篩選得到所需抗體；通過這項(xiàng)技術(shù)不僅可以篩選到一般抗原的特異性抗體，也可以產(chǎn)生非免疫原性或毒性抗原的抗體，能夠產(chǎn)生具有識別功能的人抗體，如 scFv、Fab、雙功能抗體，及三價(jià)四價(jià)抗體等。所得到的抗體可以是 Fab、scFv，也可以進(jìn)行抗體工程改造，轉(zhuǎn)變成其他形式的小分子抗體、免疫毒素、靶向細(xì)胞因子或全抗體等，應(yīng)用廣泛；相較于免疫動物生產(chǎn)單克隆抗體，利用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體，生產(chǎn)快速，操作簡便，效率更高，且可以進(jìn)行人源化抗體的生產(chǎn)，具有更高的利用價(jià)值。
經(jīng)過多年的研究與發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)已成為一門綜合了多個(gè)學(xué)科理論、方法及策略的前沿技術(shù)，在免疫學(xué)、分      子生物學(xué)、基因功能組學(xué)和新藥研究等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。下面列出了各個(gè)噬菌體展示系統(tǒng)的一些應(yīng)用案例：

表 3. 各個(gè)噬菌體展示系統(tǒng)的應(yīng)用案例