單克隆抗體制備服務
 利用雜交瘤制備單克隆抗體通常操作流程為：抗原制備、用抗原免疫動物、取免疫動物的脾臟細胞與骨髓瘤細胞融      合成雜交瘤細胞、對雜交瘤細胞進行篩選及克隆化、利用篩選得到的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的大量生產(chǎn)。
 

抗原制備

用于制備單克隆抗體的抗原純度越高，單抗制備實驗的成功率越高。一般來說，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重組蛋白）、多肽、小分子等。

免疫動物
免疫動物的選擇

通常，根據(jù)所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠或大鼠作為免疫動物。因為，   所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于 LOU/c 大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。就小鼠而言，一般選用 6-8 周齡雌性 Balb/c 小鼠。

制定免疫方案

免疫方案應根據(jù)抗原的特性不同而定，選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的 McAb 至關重要。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原，在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、      免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等?，F(xiàn)用的免疫程序與多克隆抗體制備的方法類似，      免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射等。

表 1 列舉了目前常用的免疫程序:

                                                                      表 1：常見的免疫程序

免疫動物
動物的免疫一般在融合前前兩個月，根據(jù)確定的免疫方案開始對動物進行初次免疫。動物的免疫通常共有三次，在      初次免疫 2~3 周后進行再次免疫，在再次免疫 3 周后進行加強免疫（如果有需要的話）。一般來說，在最后一次加強免疫后第 3 天取脾進行融合較適宜。由不同抗原產(chǎn)生免疫反應的能力也有強有弱，因此在注射抗原的同時，常常會加入佐劑，以增強抗原的抗原性，刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應。

制備雜交瘤細胞
細胞融合前準備
脾淋巴細胞制備

已經(jīng)免疫的 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠），在無菌條件下去除脾臟，并完成脾淋巴細胞的制備。
 注意：制備脾淋巴細胞過程中，通常也會進行小鼠眼球摘除采血的的操作，將血清分離后作為抗體檢測時陽性對照血清。

骨髓瘤細胞制備

骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交瘤融合效率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAB。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM 培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%~20%，細胞濃度以 104~105/ml 為宜，最大濃度不得超過 106/ml。當細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按 1:3~1:10 的比例傳代。每 3~5 天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應定期用 8-氮鳥嘌呤處理，使生存的細胞對 HAT 呈均一的敏感性。
 

飼養(yǎng)細胞

在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它細胞，則可使這些細胞生長繁殖，這種加入的細      胞稱為飼養(yǎng)細胞。在細胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散      的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入飼養(yǎng)細胞使之繁殖。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔細胞、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。

細胞融合
1） 進行雜交瘤制備的具體操作方法有多種，這里介紹比較常用的一種，讀者如果有興趣可以在網(wǎng)上找其他的操作方法：將骨髓瘤細胞與脾細胞按 1:10 或 1:5 的比例混合在一起，在 50ml 離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗 1 次， 離心，1200r/min 8 分鐘，棄去上清，用吸管吸凈殘留液體（為了避免影響 PEG 的濃度），輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。
2）用吸管在 60s 內(nèi)（時間最好控制在 45s 左右）加預熱至 40℃的 50% PEG（PH 8.0） 1ml，邊加邊輕輕攪
拌。

3） 用 10ml 吸管在 90s 內(nèi)加 20-30ml 預熱的不完全培養(yǎng)基（終止 PEG 作用）；20-27℃靜置 10 分鐘。

4） 1000r/min 離心 6 分鐘，棄上清

5） 加入 5ml HAT 培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的 HAT 培養(yǎng)基至80-100ml。

6） 分裝 96 孔細胞培養(yǎng)板（孔板內(nèi)有飼養(yǎng)細胞層），每孔 0.1-0.15ml（或分裝 24 孔板，每孔 1.0-1.5ml）， 然后將培養(yǎng)板置 37℃，6% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7） 5 天后用 HAT 培養(yǎng)基換出 1/2 培養(yǎng)
      1. 7-10 天后用 HT 培養(yǎng)基換出 HAT 培養(yǎng)基；
      2. 經(jīng)常觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其長至孔底面積 1/10 以上時吸出上清供抗體檢測。說明：上述步驟中，a~d 為 PEG 介導的細胞融合，e~i 為融合后的 HAT 篩選

融合細胞的篩選

脾細胞和骨髓瘤細胞經(jīng) PEG 處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在 HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在 HAT 選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。
 

雜交瘤細胞的克隆化
所謂克隆化是指使單個細胞無性繁殖而獲得該細胞團體的整個培養(yǎng)過程。通常在得到針對預定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進行 2-3 次克隆化，有時還需進行多次。克隆化的方法很多，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細胞顯微操作法、單克隆細胞集團顯微操作法和熒光激活細胞分類儀（FACS）分離法。（相關閱讀：雜交瘤細胞亞克隆常用方法） 雜交瘤細胞克隆化的意義

從原始孔中得到的陽性雜交瘤細胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細胞進行克隆化。另一方面，雜交瘤細胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已經(jīng)不再分泌抗體的細胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞系，也需要克隆化。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細胞，復蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，      因此也應作克隆化，以檢測抗體分泌情況。

雜交瘤細胞的凍存
雜交瘤細胞制備單克隆抗體的過程中，通常將一部分雜交瘤細胞凍存起來備用，便于以后大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體以      及避免外部不可測的影響因素對實驗帶來過大的影響。

利用雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗
利用雜交瘤細胞大量制備單克隆目前主要有兩種方法，一種是動物體內(nèi)生產(chǎn)法，另外一種是體外培養(yǎng)法。

動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法
鑒于絕大多數(shù)動物用雜交瘤均由 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠）的骨髓瘤細胞與同品系的脾細胞融合而得，因此使用的動物首選 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠）。將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤， 并產(chǎn)生腹水，可得到大量的腹水單抗。該法操作簡便、經(jīng)濟且抗體濃度很高。但是，腹水中常混有小鼠的各種雜蛋      白（包括 Ig），因此得到的腹水抗體要提純后才能使用。

體外培養(yǎng)法
體外培養(yǎng)可以采用單層細胞培養(yǎng)的形式，也可以采用懸浮培養(yǎng)的形式。細胞體外培養(yǎng)一定時間后，收集培養(yǎng)上清液，      離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆。抗體相較于免疫動物生產(chǎn)單克隆抗體的方法，體外培養(yǎng)不需要對得到的抗體進行純化，但該法的產(chǎn)量較低且費用昂貴。

抗體的檢測
檢測抗體的方法有多種，根據(jù)抗體類型的不同，可以選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法      為優(yōu)先。其中最常用的為酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法。

ELISA 的原理為：將使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，使抗體（或抗原）與某種酶連接成酶標抗體（或抗原），將待測抗體與酶標抗體（或抗原）按不同的步驟與固相載體表面的抗原（或抗體）起反應。最終結(jié)合在固      相載體的酶標抗體量與待檢測抗體的量呈一定比例。加入酶反應底物，底物被酶催化顯色，根據(jù)顏色的深淺便進行      定性或定量分析。

其它常用的方法有:
放射免疫測定（RIA） 可用于可溶性抗原、細胞 McAb 的檢測。免疫熒光試驗 適合于細胞表面抗原的 McAb 的檢測。
其它檢測方法如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。