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《天然小分子化合物反向?qū)ぐ袌?bào)告》

1 目的
      針對(duì)客戶提供的1個(gè)化合物進(jìn)行反向虛擬篩選，結(jié)果返回給客戶。

2 材料與方法

    2.1 反向虛擬篩選材料

  客戶提供的1個(gè)化合物見(jiàn)表 1。
  表1.客戶提供的五個(gè)化合物
 

1. 2.2 反向虛擬篩選流程

         對(duì)接軟件：Glide或者Vina軟件。
         方法：基于受體的反向虛擬篩選方法基于分子對(duì)接原理，將小分子化合物一一對(duì)接到靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶標(biāo)活性位點(diǎn)上，根據(jù)化合物-靶標(biāo)的結(jié)合能大小打分排序，結(jié)合能越低，排名越前，潛在靶標(biāo)的可能性越大。

3 結(jié)果與分析
      每個(gè)化合物結(jié)果文件包括得分排名前500 對(duì)接文件信息，對(duì)接得分排序的前500個(gè)結(jié)果見(jiàn)列表Top_Target_500.csv 文件，我們挑選其中前50名小分子進(jìn)行重點(diǎn)分析，如下表所示：
      挑選能量最好、聚類最多的小分子位相用于結(jié)果分析。

       以 compound1-Whole庫(kù)反向虛擬篩選排名第一的靶標(biāo)結(jié)果為例，簡(jiǎn)要介紹如何通過(guò)靶標(biāo)信息分析和結(jié)合模式分析來(lái)查看反向虛擬篩選結(jié)果。compound1 排名第一的靶標(biāo)為Cytochrome P450 11B2, mitochondrial[Homo sapiens]（第一列），靶標(biāo)蛋白質(zhì)文件為4dvq_1CA_10_[J]（第三列，意思是PDBID:4dvq，結(jié)晶結(jié)構(gòu)配體名稱1CA，chain ID：J鏈）。在篩選時(shí)，如果篩選的目標(biāo)蛋白為人源蛋白，非篩選的蛋白為其他物種來(lái)源，則需要考慮其他物種來(lái)源蛋白與人員蛋白的序列同源性，否則可以直接放棄此靶標(biāo)。
    
    3.2.1 靶標(biāo)信息分析
    Compound1 排名第一的靶標(biāo)為 cyclin-dependent kinase 2 isoform 1 [Homo sapiens]， 靶標(biāo)相關(guān)信息在Top_Target_500.csv 文件，詳細(xì)介紹可參考幫助文檔 http://reversedock.vslead.com/index.php?r=site/help。通過(guò)對(duì)已知化合物的藥理活性、治療領(lǐng)域的了解，結(jié)合 Top_Target_500.csv文件中的靶標(biāo)UNP_AC（第四列）數(shù)據(jù)，去對(duì)應(yīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)搜索更全面靶標(biāo)信息，最終確定化合物的潛在作用靶標(biāo)。

    3.2.2 化合物和靶標(biāo)蛋白結(jié)合模式分析        
    compound1排名第一的結(jié)果文件為4dvq_10_1CA.pdbqt 和4dvq_10_1CA.log。4dvq_10_1CA.log為化合物對(duì)接后構(gòu)象得分。分析4dvq_10_1CA.pdbqt化合物對(duì)接后構(gòu)象，可用可視化軟件（如 Pymol，如Pymol打開(kāi)有問(wèn)題顯示化合物鍵有問(wèn)題，可用Discovery Studio）打開(kāi)，結(jié)合蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)（此處為 PDBID: 4dvq，在http://www.rcsb.org/下載即可），分析化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合模式（圖2）和靜電表面結(jié)合情況（圖3）

圖2 結(jié)合模式圖 A) 晶體結(jié)構(gòu)pdb:4dvq 結(jié)合模式圖； B)compound1 與 pdb:4dvq結(jié)合模式圖

圖3靜電表面圖晶體結(jié)PDB:4DVQ ，棍狀化合物分別為配體1CA(green)和COM1（cartoon）。
該部分為前期數(shù)據(jù)結(jié)束以后，客戶最廣泛要做的業(yè)務(wù)，在此提供僅供參考    

4 基于鑒定蛋白的藥物分子設(shè)計(jì)與化學(xué)修飾
    計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)
    在鑒定所得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，徹底分析了XYZ蛋白結(jié)合口袋周圍理化性質(zhì)，報(bào)告如下：（a）突變前：小分子包圍在疏水口袋，親水氨基酸R125、E154與其形成氫鍵鉚釘作用，使其牢牢穩(wěn)固在蛋白質(zhì)中；（a）突變后：疏水環(huán)境大致不變，但氨基酸N125、I154造成很大空隙，親水性轉(zhuǎn)換為疏水口袋，穩(wěn)定性降低。

    分子動(dòng)力學(xué)方法
    利用分子動(dòng)力學(xué)方法對(duì)XYZ蛋白突變后與小分子Hormone間相互作用狀況進(jìn)行了計(jì)算模擬分析，以期得到蛋白質(zhì)在突變后的小分子結(jié)合信息。

基于體內(nèi)原生激素Hormone的藥物設(shè)計(jì)
    化學(xué)片段增長(zhǎng)設(shè)計(jì)法
    基于分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果，基于W1水分子相關(guān)信息，對(duì)Region B區(qū)域進(jìn)行了化學(xué)片段結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。首先設(shè)計(jì)的化學(xué)片段，將能夠有效的到達(dá)W1水分子附近，或?qū)⑵涮鎿Q掉。共設(shè)計(jì)母核結(jié)構(gòu)50枚，且均具備有機(jī)合成實(shí)驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)的可能性。

    分子對(duì)接方法判定最佳化學(xué)母核結(jié)構(gòu)
    利用分子對(duì)接方法，將50枚母核結(jié)構(gòu)分別對(duì)接進(jìn)入突變后蛋白質(zhì)XYZ結(jié)構(gòu)中，利用分子對(duì)接權(quán)重值，判定3枚小分子藥物在對(duì)接結(jié)果中占據(jù)較好的權(quán)重位置。采用C2、C1和C3進(jìn)行后期化學(xué)結(jié)構(gòu)改造。

    新型母核結(jié)構(gòu)修飾，分子再對(duì)接
    對(duì)C2~3三類化合物進(jìn)行化學(xué)片段化結(jié)構(gòu)修飾。尤其以第2類C2化合物為重點(diǎn)研究對(duì)象?；贑2化合物，共設(shè)計(jì)化學(xué)片段78枚，而后再對(duì)這78枚新型化學(xué)分子進(jìn)行Molecular docking操作，預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)屬性。

    通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬，計(jì)算蛋白質(zhì)Protein與小分子Ligand之間的能量體系，將最有能量體系進(jìn)行排名，得到前50位較好能量體系的小分子。

    化學(xué)合成
    得到化合物結(jié)構(gòu)后，進(jìn)行化學(xué)合成工作。

體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)
（1）腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)
（2）細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)
    細(xì)胞毒性、細(xì)胞遷移、活細(xì)胞成像、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像、非標(biāo)記活細(xì)胞成像。

    非常好的結(jié)果是：活性實(shí)驗(yàn)良好，特別是C2-1等10個(gè)化合物對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞活性數(shù)據(jù)IC50=45nm，具備極高的成藥潛在性。

動(dòng)物腫瘤模型構(gòu)建
      成立生物活性實(shí)驗(yàn)室，加速動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。
      將乳腺癌腫瘤細(xì)胞系，稀釋注射進(jìn)入小白鼠、大白鼠、白兔和黑猩猩體內(nèi)，成功得到動(dòng)物體內(nèi)腫瘤模型。
動(dòng)物體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)