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  NanoTemper Technologies公司Prometheus NT.48蛋白質(zhì)穩(wěn)定檢測，采用nanoDSF技術(shù)，測量蛋白穩(wěn)定性，具有超高分辨率。
 

 
       nanoDSF是一種先進的差示掃描熒光技術(shù)，具有超高分辨率，利用蛋白中色氨酸和酪氨酸自發(fā)熒光檢測其穩(wěn)定性。它廣泛應用于抗體工程、膜蛋白研究、制劑和質(zhì)量控制等領(lǐng)域。采用 nanoDSF 技術(shù)，簡單、快速、準確地分析蛋白折疊和穩(wěn)定性。

       完全無標記，僅通過檢測色氨酸和酪氨酸自發(fā)熒光的變化即可分析蛋白的化學和熱穩(wěn)定性?；跓o可比擬的掃描速度和數(shù)據(jù)點密度，NanoTemper的雙UV技術(shù)可動態(tài)檢測熒光變化，獲得具有超高分辨率的去折疊曲線。數(shù)據(jù)不受樣品聚集的影響，甚至可以檢測到瞬間的去折疊信號。

      由于無需外加熒光染料，蛋白樣品測試不受緩沖液的限制，其濃度可上達250 mg/ml，下至5 ug/ml。因此適用于研究含去垢劑的膜蛋白和高濃度的抗體制劑。
背向反射法測定蛋白聚集

      Prometheus NT.48 (PR NT.48) 可在 15 - 95°C 范圍內(nèi)同時持續(xù)加熱處理多達 48 個樣品，升溫速率可在 0.1 - 7°C/min 按需調(diào)整，并同時收集樣品的熒光和背向反射信號。因此，樣品的聚集起始溫度和對應的熔融溫度可在多達 48 種不同的條件下同時測定。此外，聚集信號表明樣品在去折疊狀態(tài)的聚集傾向，是生物制劑長期穩(wěn)定性的重要參數(shù)。

      PR NT.48 利用背向反射光學原理檢測蛋白的聚集。光穿過載有目標蛋白的毛細管。如果沒有發(fā)生蛋白聚集，所有入射光穿過毛細管并被毛細管托盤反射，監(jiān)測到的信號由檢測器定量；如果蛋白樣品含有聚集顆粒，入射光則被散射。通過檢測損失掉的光信號，蛋白樣品的聚集得以精確測定。
化學變性和熱變性
 

      熱變性和化學變性廣泛應用于量化蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。熱變性是監(jiān)測在持續(xù)穩(wěn)定升溫條件下蛋白構(gòu)象隨時間的變化，而化學變性則研究蛋白在變性劑作用下的去折疊過程。

      大多數(shù)蛋白的熱變性發(fā)生在一個較窄的溫度范圍內(nèi)。蛋白從折疊到去折疊轉(zhuǎn)變過程的中點被稱為熔融溫度，即Tm值。它是衡量蛋白穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。熱變性實驗可對大量樣品快速平行進行，因而特別適用于蛋白工程、制劑開發(fā)和篩選等研究。

      除了熱變性實驗之外，類似的去折疊曲線也可以通過化學變性測試獲得，進而反映蛋白折疊和去折疊過程中的熱力學參數(shù)和平衡信息。

內(nèi)源熒光檢測去折疊

      蛋白中色氨酸和酪氨酸熒光受其所在微環(huán)境的影響很大，尤其是色氨酸熒光，蛋白結(jié)構(gòu)的變化通常會影響其強度和發(fā)射波長。PR NT.48 儀器配備的熒光檢測器可測定樣品在兩種波長（350 nm 和 330 nm）下的熒光強度，因而可以靈敏的檢測到蛋白去折疊過程中熒光強度和熒光峰值的變化。

      通過變性曲線可以得到蛋白穩(wěn)定性的重要參數(shù)。衡量目標蛋白的熱穩(wěn)定性可通過參數(shù)熔融溫度（Tm），即一半蛋白去折疊時的溫度。Tm值可根據(jù)色氨酸單熒光強度變化計算，也可以通過色氨酸在 330nm 和 350nm 發(fā)散波長下熒光比值計算。

      通過 F350 / F330 比值所獲得的數(shù)據(jù)通?？梢郧逦拿枋龅鞍兹フ郫B的轉(zhuǎn)變過程，但有時單波長的檢測數(shù)據(jù)并不能導出 Tm 值，而 PR NT.48 雙波長檢測系統(tǒng)則可以靈敏檢測蛋白的去折疊過程。

技術(shù)特征

1. 天然的 DSF – 無需染料，可在任意緩沖液和去垢液中進行測試

2. 超高分辨率：每3秒鐘可測試48根毛細管

3. 同時檢測蛋白去折疊和聚集情況

4. 檢測范圍廣泛：蛋白濃度從5 μg/ml 到 > 250 mg/ml

5. 溫度范圍：從15°C到 95°C

6. 熱變性和化學變性