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原核表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)問題解析
 

一、外源 DNA 片段成功插到載體里面（PCR 鑒定），但無法表達(dá)蛋白

一般判斷目的基因是否表達(dá)，首先要進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測。跑膠的時(shí)候一定要設(shè)對照：Marker，標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照， 以及空白載體（誘導(dǎo)）和重組載體（不誘導(dǎo)）2 個(gè)陰性對照，再加上誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)結(jié)果。跑 SDS-PAGE 的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在 100ng 左右；但是不能跟著做 western blot 了。銀染的靈敏度在 0.1～1 ng； 或是 Sypro Red，靈敏度高還可以繼續(xù)做 Western blot。

在做過 Western Blot 仍沒有檢測到表達(dá)帶，那么就要先判斷載體的多克隆位點(diǎn)和片斷插入的序列，是否有因?yàn)槊盖羞B接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號。其次要對測序結(jié)果進(jìn)行確定，確定插入的每個(gè)堿基都是正確的，沒有意外終止      的情況。最后，也需要注意基因中是否有稀有密碼子，可更換表達(dá)菌株。

每種菌株都有自己獨(dú)特的設(shè)計(jì)，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更穩(wěn)定，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像 pET 系列就一定需要有 T7 RNA 聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采用不同調(diào)控機(jī)制會(huì)使用不同的表達(dá)菌株，所以換菌株一定要仔細(xì)看過載體的調(diào)控方式再換。例如，使用 BL21（DE3）菌株表達(dá)不成功可以嘗試用 Rosetta 系列菌株表達(dá)，它能夠由一種氯霉素抗性的、與 pET 相容的質(zhì)粒提供 AUA，AGG，AGA，CUA，CCC 和 GGA 的 tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。有時(shí)不明原因的表達(dá)蛋白截短（比預(yù)期的分子量要小很多）      也可能是由于稀有密碼子造成的。

沒有發(fā)現(xiàn)原則性錯(cuò)誤之后，可以從表達(dá)條件入手，梯度條件改變表達(dá)溫度、IPTG 濃度，低溫、較長時(shí)間的表達(dá)有利于蛋白穩(wěn)定、融合表達(dá)；低濃度的 IPTG 可以減少化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞的損傷。而且培養(yǎng)基中的葡萄糖可能會(huì)抑制表達(dá)。導(dǎo)致表達(dá)的蛋白與預(yù)期的不同。如果嘗試改變條件后依然沒有表達(dá)，可以試試換不同的培養(yǎng)基（如 LB、TB、M9 等）。

如果以上方法均無法表達(dá)出目的蛋白，可更換載體-表達(dá)系統(tǒng)。在換過不同載體，不同菌株之后仍是表達(dá)不出來的      話，可以嘗試其它的表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)橛行┑鞍资窃诖竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)中無法表達(dá)。

二、蛋白表達(dá)出來了，但是跑 SDS-PAGE 時(shí)大小不符?

SDS-PAGE 時(shí)蛋白的凈電荷會(huì)影響遷移率。帶電量高的蛋白會(huì)結(jié)合較少的 SDS，阻礙蛋白的泳動(dòng)。富含脯氨酸的蛋白會(huì)在 SDS-PAGE 膠中移動(dòng)得特別慢。如果蛋白的等電點(diǎn)在 5~9 之間，并且組成的氨基酸組分沒有明顯的偏好， 那么目的蛋白遷移率與預(yù)期相差較遠(yuǎn)就很有可能不是由于凝膠電泳造成的，可能是稀有密碼子造成表達(dá)產(chǎn)物的截
短。利用 C 端或者 N 端的標(biāo)簽進(jìn)行 Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而導(dǎo)致多條目的條帶或者比預(yù)期小很多的條帶出現(xiàn)。

三、重組表達(dá)的蛋白為不可溶包涵體

大多數(shù)在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白都是以包涵體形式存在。一般情況下，形成包涵體表達(dá)產(chǎn)率都很高，并且容易分離，得到比較純的包含體。包涵體致密的結(jié)構(gòu)有助于防止蛋白酶對它的降解作用，如果毒性較強(qiáng)的蛋白形成包涵體也就不會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生太大的損傷。如果表達(dá)蛋白的目的是為了作為抗原制備抗體，那么可以用 PBS 將包涵體懸浮， 使用佐劑將溶液乳化后注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫。

包含體的形成據(jù)分析原因之一在于表達(dá)量過高，表達(dá)產(chǎn)物來不及折疊為活性形式——多數(shù)以高表達(dá)見長的表達(dá)系統(tǒng)      都會(huì)得到包含體產(chǎn)物。如果融合表達(dá)含有標(biāo)簽，常用的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性的情況下進(jìn)行純化，然      后復(fù)性。
四、如何獲取可溶性蛋白

如果需要獲得具有一定活性的表達(dá)蛋白，那么最好讓蛋白可溶形式表達(dá)，避免包涵體形成。避免包涵體的方法很多，      比如：選用表達(dá)量不高的表達(dá)系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達(dá)的融合表達(dá)系統(tǒng)比如 pThio，pMal 等等，對于 T7 系統(tǒng)來說降低或者減少誘導(dǎo)條件（例如降低 ITPG 濃度減少 T7 聚合酶）從而降低表達(dá)速度，使用基本培養(yǎng)基等也有助于可溶性表達(dá)。另外一個(gè)容易忽視的問題是大腸桿菌內(nèi)還原性過高會(huì)導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物不溶，更換菌株例如 Novagen 的 Origami 系列也有助于解決這個(gè)問題。還有一種方法是當(dāng)?shù)鞍讙煸谥由系臅r(shí)候，在還原和氧化的谷胱甘肽存在的情況下用濃度從 6M 到 0M 的鹽酸胍過柱，促使蛋白的折疊。在蛋白重新折疊后用咪唑洗脫。德泰的上清蛋白表達(dá)服務(wù)通過條件矩陣正交優(yōu)化的方法，使重組蛋白表達(dá)在上清液中，即獲得具有相當(dāng)活性的表達(dá)蛋白

五、切除標(biāo)簽時(shí)引入的蛋白酶是否一定要切除?

很多時(shí)候我們要用蛋白酶除去加入的標(biāo)簽，在蛋白酶切除標(biāo)簽后是否一定要去除呢?有人認(rèn)為蛋白酶與目的蛋白加入的比例是 1:500 甚至更低，蛋白酶是不會(huì)影響到下一步操作的，在一些粗放的生化實(shí)驗(yàn)不用去處蛋白酶。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮罄^實(shí)驗(yàn)需要將蛋白酶除去。很多公司已經(jīng)開發(fā)出帶有標(biāo)簽的蛋白酶，使得僅通過過親和柱就可以方便的去除蛋白      酶和融合標(biāo)簽。Tag-Free 技術(shù)與傳統(tǒng)的標(biāo)簽切除技術(shù)不同，不存在蛋白酶引入導(dǎo)致雜蛋白影響的情況，具體對比如下：