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生物計(jì)算資料

計(jì)算輔助藥物設(shè)計(jì)

《文章方案》
          ---抑制劑或者激動(dòng)劑高通量篩選

一、小分子化合物或者靶點(diǎn)蛋白高通量計(jì)算篩選

1 目的
  1.1針對(duì)客戶提供的1個(gè)化合物或者靶蛋白進(jìn)行高通量計(jì)算篩選;
  1.2針對(duì)醫(yī)口客戶:已知與腫瘤或者其他疾病相關(guān)的靶蛋白,需要尋找靶點(diǎn)蛋白的抑制劑或激動(dòng)劑;
  1.3針對(duì)中醫(yī)藥客戶:已知中藥主要單體成分,尋找中藥或天然藥物的作用靶點(diǎn)等作用機(jī)制;

2 虛擬篩選材料

    2.1 虛擬篩選材料

   客戶提供的1個(gè)化合物或靶蛋白,見表 1。
                                        表1.客戶提供的1個(gè)化合物
 計(jì)算輔助藥物設(shè)計(jì)

   2.2 虛擬篩選流程

         對(duì)接軟件: MOE、GOLD、 Glide或者Vina軟件。
         方法:基于受體的反向虛擬篩選方法基于分子對(duì)接原理,將小分子化合物一一對(duì)接到靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫的靶標(biāo)活性位點(diǎn)上,根據(jù)化合物-靶標(biāo)的結(jié)合能大小打分排序,結(jié)合能越低,排名越前,潛在靶標(biāo)的可能性越大。

蛋白對(duì)接篩選庫:我們針對(duì)Scpdb數(shù)據(jù)庫,并結(jié)合我們自行研發(fā)的反向虛擬篩選數(shù)據(jù)庫,利用對(duì)接軟件進(jìn)行反向虛擬對(duì)接篩選,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫共計(jì)23456種類蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫整合了目前RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中所有已知晶體蛋白結(jié)構(gòu)類型數(shù)據(jù),具有最為全面的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)信息。對(duì)1個(gè)化合物分別提交反向虛擬篩選任務(wù)并返回前500個(gè)分子對(duì)接結(jié)果。


3 結(jié)果與分析
      每個(gè)化合物結(jié)果文件包括得分排名前200 對(duì)接文件信息,對(duì)接得分排序的前500個(gè)結(jié)果見列表Top_Target_200.csv 文件,我們挑選其中前50名小分子進(jìn)行重點(diǎn)分析,如下表所示:
      挑選能量最好、聚類最多的小分子位相用于結(jié)果分析。
化合物反向?qū)ぐ?

       以 compound1-Whole庫反向虛擬篩選排名第一的靶標(biāo)結(jié)果為例,簡(jiǎn)要介紹如何通過靶標(biāo)信息分析和結(jié)合模式分析來查看反向虛擬篩選結(jié)果。compound1 排名第一的靶標(biāo)為Cytochrome P450 11B2, mitochondrial[Homo sapiens](第一列),靶標(biāo)蛋白質(zhì)文件為4dvq_1CA_10_[J](第三列,意思是PDBID:4dvq,結(jié)晶結(jié)構(gòu)配體名稱1CA,chain ID:J鏈)。在篩選時(shí),如果篩選的目標(biāo)蛋白為人源蛋白,非篩選的蛋白為其他物種來源,則需要考慮其他物種來源蛋白與人員蛋白的序列同源性,否則可以直接放棄此靶標(biāo)。
    
    3.2.1 靶標(biāo)信息分析
    Compound1 排名第一的靶標(biāo)為 cyclin-dependent kinase 2 isoform 1 [Homo sapiens], 靶標(biāo)相關(guān)信息在Top_Target_500.csv 文件,詳細(xì)介紹可參考幫助文檔 http://reversedock.vslead.com/index.php?r=site/help。通過對(duì)已知化合物的藥理活性、治療領(lǐng)域的了解,結(jié)合 Top_Target_500.csv文件中的靶標(biāo)UNP_AC(第四列)數(shù)據(jù),去對(duì)應(yīng)UniProt數(shù)據(jù)庫搜索更全面靶標(biāo)信息,最終確定化合物的潛在作用靶標(biāo)。

    3.2.2 化合物和靶標(biāo)蛋白結(jié)合模式分析        
    compound1排名第一的結(jié)果文件為4dvq_10_1CA.pdbqt 和4dvq_10_1CA.log。4dvq_10_1CA.log為化合物對(duì)接后構(gòu)象得分。分析4dvq_10_1CA.pdbqt化合物對(duì)接后構(gòu)象,可用可視化軟件(如 Pymol,如Pymol打開有問題顯示化合物鍵有問題,可用Discovery Studio)打開,結(jié)合蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(此處為 PDBID: 4dvq,在http://www.rcsb.org/下載即可),分析化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合模式(圖2)和靜電表面結(jié)合情況(圖3)


化合物反向?qū)ぐ?
圖2 結(jié)合模式圖 A) 晶體結(jié)構(gòu)pdb:4dvq 結(jié)合模式圖; B)compound1 與 pdb:4dvq結(jié)合模式圖
化合物反向?qū)ぐ?
圖3靜電表面圖晶體結(jié)PDB:4DVQ ,棍狀化合物分別為配體1CA(green)和COM1(cartoon)。
該部分為前期數(shù)據(jù)結(jié)束以后,客戶最廣泛要做的業(yè)務(wù),在此提供僅供參考
    

4 基于鑒定蛋白的藥物分子設(shè)計(jì)與化學(xué)修飾
    計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)
    在鑒定所得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,徹底分析了XYZ蛋白結(jié)合口袋周圍理化性質(zhì),報(bào)告如下:(a)突變前:小分子包圍在疏水口袋,親水氨基酸R125、E154與其形成氫鍵鉚釘作用,使其牢牢穩(wěn)固在蛋白質(zhì)中;(a)突變后:疏水環(huán)境大致不變,但氨基酸N125、I154造成很大空隙,親水性轉(zhuǎn)換為疏水口袋,穩(wěn)定性降低。
靶蛋白

分子動(dòng)力學(xué)方法
    利用分子動(dòng)力學(xué)方法對(duì)XYZ蛋白突變后與小分子Hormone間相互作用狀況進(jìn)行了計(jì)算模擬分析,以期得到蛋白質(zhì)在突變后的小分子結(jié)合信息。

a)突變后XYZ蛋白Region A區(qū)域沒有變化,對(duì)該部分不做任何修改;

bRegion B區(qū)域中,小分子下方出現(xiàn)巨大空洞,需要對(duì)該部分進(jìn)行補(bǔ)漏;

cRegion B區(qū)域巨大空襲,在小分子穩(wěn)定結(jié)合時(shí),下方出現(xiàn)由10~13個(gè)水分子組成的“水氫鍵網(wǎng)絡(luò)體系”;

d)“水氫鍵網(wǎng)絡(luò)體系”中,水分子能量Energy(球體大?。┖驼加新?/span>Occupancy(球體顏色)均能表達(dá)出蛋白質(zhì)局部區(qū)域理化性質(zhì)。

具體總結(jié)為Region B區(qū)域絕大多數(shù)水分子能量Energy極小、占有率Occupancy較小,說明該區(qū)域極為疏水;但其中W1水分子,能量較好、占有率較高,說明W1水分子極為穩(wěn)定,周圍氨基酸為極親水性氨基酸,將來可以通過替換W1水分子或通過橋鍵作用對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾


化合物反向?qū)ぐ?
化合物反向?qū)ぐ?

基于體內(nèi)原生激素Hormone的藥物設(shè)計(jì)
    化學(xué)片段增長(zhǎng)設(shè)計(jì)法

    基于分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果,基于W1水分子相關(guān)信息,對(duì)Region B區(qū)域進(jìn)行了化學(xué)片段結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。首先設(shè)計(jì)的化學(xué)片段,將能夠有效的到達(dá)W1水分子附近,或?qū)⑵涮鎿Q掉。共設(shè)計(jì)母核結(jié)構(gòu)50枚,且均具備有機(jī)合成實(shí)驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)的可能性。
化合物反向?qū)ぐ?

    分子對(duì)接方法判定最佳化學(xué)母核結(jié)構(gòu)
    利用分子對(duì)接方法,將50枚母核結(jié)構(gòu)分別對(duì)接進(jìn)入突變后蛋白質(zhì)XYZ結(jié)構(gòu)中,利用分子對(duì)接權(quán)重值,判定3枚小分子藥物在對(duì)接結(jié)果中占據(jù)較好的權(quán)重位置。采用C2、C1和C3進(jìn)行后期化學(xué)結(jié)構(gòu)改造。

化合物反向?qū)ぐ?


    新型母核結(jié)構(gòu)修飾,分子再對(duì)接
    對(duì)C2~3三類化合物進(jìn)行化學(xué)片段化結(jié)構(gòu)修飾。尤其以第2類C2化合物為重點(diǎn)研究對(duì)象。基于C2化合物,共設(shè)計(jì)化學(xué)片段78枚,而后再對(duì)這78枚新型化學(xué)分子進(jìn)行Molecular docking操作,預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)屬性。
化合物反向?qū)ぐ?0

    通過分子動(dòng)力學(xué)模擬,計(jì)算蛋白質(zhì)Protein與小分子Ligand之間的能量體系,將最有能量體系進(jìn)行排名,得到前50位較好能量體系的小分子。
化合物反向?qū)ぐ?1

    化學(xué)合成
    得到化合物結(jié)構(gòu)后,進(jìn)行化學(xué)合成工作。
化合物反向?qū)ぐ?2
二,SPR體外檢測(cè)靶點(diǎn)蛋白與小分子間親和力,挑選活性最好小分子:
通過傳感芯片可實(shí)時(shí)、原位和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生物分子間的相互作用,并比較各小分子間親和力強(qiáng)弱,選擇活性最好小分子作為備選;
靶蛋白2
SPR分子互作平臺(tái)適用于各類生物體系的測(cè)定,小分子-蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),DNA-蛋白質(zhì),DNA-DNA等;


三、加載XX藥物的XX納米藥物載體治療XX 癌癥中的藥效學(xué)研究
1、立項(xiàng)依據(jù):
     首先通過藥物虛擬篩選以及LSPR分子互作平臺(tái)挑選出活性最優(yōu)小分子,作為靶標(biāo)蛋白的最優(yōu)抑制劑備選,一般化合物對(duì)正常的細(xì)胞毒性比較大,為了解決這一問題,構(gòu)建生物相容性好、藥物加載量大、緩釋性能好的納米藥物載體,可以長(zhǎng)時(shí)間緩慢釋放藥物,減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性,并有效地殺死癌細(xì)胞,為癌癥治療提供理論依據(jù)。
2、項(xiàng)目數(shù)據(jù):
2.1篩選數(shù)據(jù):

     2.1.1藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)
     2.1.2藥物與靶標(biāo)結(jié)核的三維結(jié)構(gòu)模擬圖
     2.1.3藥物與靶標(biāo)的親和常數(shù);
     2.1.4藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
2.2納米材料合成: 
     2.2.1納米材料的TEM、SEM形貌表征圖
     2.2.2 納米材料的動(dòng)態(tài)光散射圖
     2.2.3 納米材料加載抗體和藥物的模擬流程圖
2.3 納米材料的生物相容性:
     2.3.1 納米材料對(duì)正常細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
2.4 納米藥物載體細(xì)胞內(nèi)化性能測(cè)試:
     2.4.1 熒光標(biāo)記的納米藥物載體如細(xì)胞的激光共聚焦檢測(cè)圖
2.5 納米藥物載體加載藥物后藥物緩釋性能研究:
     2.5.1 藥物全波長(zhǎng)掃描得出藥物最高吸收峰數(shù)據(jù)
     2.5.2 納米藥物載體對(duì)藥物的緩釋曲線
2.6 納米藥物載體夾雜藥物后對(duì)正常細(xì)胞的毒性及對(duì)癌細(xì)胞的毒性
     2.6.1 納米藥物載體加載藥物后對(duì)正常細(xì)胞的毒性
     2.6.2納米藥物載體夾加載物后癌癥細(xì)胞的毒性
     2.6.3 納米藥物載體夾加載物后處理癌細(xì)胞對(duì)靶標(biāo)相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)的影響
2.7 納米藥物載體對(duì)皮下實(shí)體瘤生長(zhǎng)速率的影響:
     2.7.1納米藥物載體對(duì)皮下實(shí)體瘤模型的影響(瘤子圖)
     2.7.2納米藥物載體對(duì)皮下實(shí)體瘤模型的影響(瘤子體積增長(zhǎng)的影響)
     2.7.3納米藥物載體對(duì)皮下實(shí)體瘤模型的影響(瘤子重量的影響)

四、體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)
(1)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)
(2)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)
    細(xì)胞毒性、細(xì)胞遷移、活細(xì)胞成像、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像、非標(biāo)記活細(xì)胞成像。
化合物反向?qū)ぐ?3

    非常好的結(jié)果是:活性實(shí)驗(yàn)良好,特別是C2-1等10個(gè)化合物對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞活性數(shù)據(jù)IC50=45nm,具備極高的成藥潛在性。

化合物反向?qū)ぐ?4

五、動(dòng)物腫瘤模型構(gòu)建
      成立生物活性實(shí)驗(yàn)室,加速動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。
      將乳腺癌腫瘤細(xì)胞系,稀釋注射進(jìn)入小白鼠、大白鼠、白兔和黑猩猩體內(nèi),成功得到動(dòng)物體內(nèi)腫瘤模型。
動(dòng)物體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)
化合物反向?qū)ぐ?5

靶蛋白3

總結(jié)
靶蛋白4