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重組蛋白表達

大腸桿菌表達系統(tǒng)

大腸桿菌蛋白表達原理
誘導(dǎo)原理:Lac 阻遏物是一種具有 4 個相同亞基的四級結(jié)構(gòu)蛋白,都有一個與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點。在沒有乳糖存在時,lac 操縱子(元)處于阻遏狀態(tài),Lac 阻遏物能與操縱基因 O 結(jié)合,阻礙 RNA 聚合酶與 P 序列結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄起動。而當有誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合后,其蛋白構(gòu)象就發(fā)生變化,導(dǎo)致阻遏物從操縱基因 O 上解離下來,RNA 聚合酶不再受阻礙,發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

大腸桿菌表達系統(tǒng)步驟
不包括基因構(gòu)建等上游操作和蛋白純化部分?;驑?gòu)建參考密碼子優(yōu)化,蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內(nèi)容主      要包括蛋白表達鑒定:
1、表達鑒定第一天的任務(wù),常用抗性選擇根據(jù)感受態(tài)細胞選擇

       拿到質(zhì)粒,離心(3000r/min;2min)

       在質(zhì)粒中加入 TE(使質(zhì)粒最終加入到 110μL 感受態(tài)細胞中的量為 80-100ng,據(jù)此確定加入 TE 的量

       一般為(1μg 質(zhì)粒加 20μLTE;2μg 質(zhì)粒加 50μLTE;5μg 質(zhì)粒加 100μL TE)

       將質(zhì)粒與 TE 混勻,加入 2μL 混液于感受態(tài)細胞中

       將感受態(tài)細胞放入冰箱(4℃)中,30min

       取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激 90s,

       再次放入冰箱(4℃)中,3min

       拿出后取 200μL 的 LB 液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細胞中

       放入搖床(37℃; 195r) 中, 30nim 至 60min; 最佳 45min)

       取出離心(3000r/min;2min)

       去掉 200μL 的上清,留 100μL 左右上清懸浮沉淀,吸取 50μL 懸液涂平板,先將對應(yīng)抗性的平板放入培養(yǎng)箱(37℃)中預(yù)熱 20min)

       把平板放入培養(yǎng)箱(37℃),過夜(12h 至 16h)

2、表達鑒定第二天的任務(wù),注意 Pcold 的表達溫度

       每個平板挑取單菌落至 4 支對應(yīng)抗性的 LB(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”
       ●將試管放入搖床(37℃;195r) 中,單抗 3h 左右;雙抗 4 左右;剛開始用可見分光光度計測 OD 值; 熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)),測 OD 值(0.6 至 0.8)
       從“0”號管中取 700μL 懸液加入到 100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存
       在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入 2μL 的 IPTG(終濃度 0.5mM 最適
       視不同的載體選擇適合的表達環(huán)境(PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達 6h;37℃表達 3h 至 4h(4 支試管,“0”“1”號試管 15℃表達過夜;“2”“3”試管 37℃表達 3h 至 4h)。Pcold:全部 15℃表達過夜)
 

3、表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度

       從每組 4 支的試管中均取 500μL 菌液加入到 1.5ml 離心管中,若 OD 值不一樣,值小的可多取離心

(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近)


       在每個離心管中加入 500μL 的 DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀

       在每支離心管中加入 45μL 的 1×PBS 和 45μL 的 2×Loading Buffer 懸浮沉淀(當溶質(zhì)適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質(zhì)多且粘稠時,應(yīng)使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量)

       放入煮樣器(100℃) 25min

       取出后離心(6000r/min) 3min, 電泳檢測。

 

大腸桿菌表達系統(tǒng)

 


質(zhì)粒載體:小型環(huán)狀 DNA,能自我復(fù)制。一個完整的質(zhì)粒載體必須要有復(fù)制起點、啟動子、插入的目的基因、篩選標記以及終止子;此外對大腸桿菌表達載體的要求是:①操縱子以及相應(yīng)的的調(diào)控序列,外源基因產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有毒害作用;②SD 序列,即核糖體識別序列,一般 SD 序列與起始密碼子之間間隔 7-13bp 翻譯效率最高;③多克隆位點以便目的基因插入到適合位置。

目的基因:在大腸桿菌表達體系中要表達的基因即外源基因,包括原核基因和真核基因;原核基因可以在大腸桿菌中直接表達出來,但是真核基因韓有內(nèi)含子不能,大腸桿菌不能對 
mRNA 進行剪切,從而形成成熟的 mRNA,所以真核基因一般以 cDNA 的形式在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達。此外還需提供大腸桿菌能識別的且能轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因的元件。


表達宿主菌:表達蛋白的生物體即大腸桿菌。表達宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達過程中是很重要的因素——多數(shù)人會直接選擇實驗室曾經(jīng)用過的宿主菌,而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據(jù)宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性,例如目的蛋白需要形成二硫鍵,可以選擇 Origami 2 系列,Origami 能顯著提高細胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率,促進蛋白可溶性及活性表達;目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta 2 系列,補充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及 CGG)稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA,提高外源基因的表達水平。


大腸桿菌表達系統(tǒng)種類


T7 大腸桿菌表達系統(tǒng)
      以 T7 啟動子、T7RNA 聚合酶等 T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系的元件為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng)。T7 RNA 聚合酶一種高活性的RNA 聚合酶,mRNA 的合成速度比大腸桿菌內(nèi)的 RNA 聚合酶快 5 倍,并某些不能被大腸桿菌 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄的序列也可以轉(zhuǎn)錄,所以 T7 RNA 聚合酶和 T7 噬箘體啟動子的存在的情況下,大腸桿菌本身的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系,最終受 T7 噬箘體啟動子控制基因的轉(zhuǎn)錄。

 


Lac 和 Tac 大腸桿菌表達系統(tǒng)
      它是以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的大腸桿菌表達系統(tǒng),具有多順反子結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)排列為:



啟動子(lacP)- 操縱基因(lacO) - 結(jié)構(gòu)基因(lacZ-lacY-lacA)
    
  原理:在無誘導(dǎo)物的情況下,負調(diào)節(jié)因子 lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合,阻止轉(zhuǎn)錄的起始。加入誘導(dǎo)劑后,IPTG 與 lacI 基因產(chǎn)物結(jié)合,使操縱基因解離出來,lac 操縱子的轉(zhuǎn)錄因此被激活。用 tac 啟動子構(gòu)建的表達系統(tǒng)稱為 Tac 表達系統(tǒng)。




PL 和 PR 大腸桿菌表達系統(tǒng)
      以啟動子 PL、PR 為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng)。PL 和 PR 表達系統(tǒng)具有很強的啟動轉(zhuǎn)錄能力,誘導(dǎo)時不需要加入化學(xué)誘導(dǎo)劑,成本低廉,但在熱刺激過程中,大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會被激活,降解所表達的外源蛋白;其次是在      大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)菌體時,通過熱平衡交換方式提高溫度,需要較長的時間,這會降低誘導(dǎo)效果,從而對重組蛋白的表達量有影響。

此外還有其他表達系統(tǒng),如 pH 調(diào)控型、營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型等。

大腸桿菌表達系統(tǒng)比較

種類

優(yōu)點

缺點

T7 大腸桿菌表達系統(tǒng)

目的基因的表達水平高

較高的本底表達

Lac 表達系統(tǒng)

易于調(diào)控和操作

對表達和制備用于醫(yī)療的重組蛋白不適合

Tac 表達系統(tǒng)

易于調(diào)控,轉(zhuǎn)錄水平高于 lac

對表達和制備用于醫(yī)療的重組蛋白不適合

PL  PR 表達系統(tǒng)

PL  PR 表達系統(tǒng)

可能降解所表達的重組蛋白,不適合大規(guī)模培養(yǎng)

大腸桿菌與其他表達系統(tǒng)比較

表達系統(tǒng)

優(yōu)點

缺點

大腸桿菌

大腸桿菌表達系統(tǒng)具有表達背景清楚,表達水平高,

表達真核基因只能用其 cDNA,不能進

表達系統(tǒng)

操作簡單,培養(yǎng)周期短,抗污染能力強

行翻譯后的修飾加工,含有大量內(nèi)毒素

哺乳動物

可以使蛋白正確折疊,提供復(fù)雜的 N 型糖基化和準

產(chǎn)率低,某些糖基化產(chǎn)物不穩(wěn)定、不易純

表達系統(tǒng)

確的 O 型糖基化等加工修飾,更接近于天然蛋白

化,費用昂貴

酵母表達系統(tǒng)

使用簡單,表達量高,可大規(guī)模生產(chǎn),
與原核相比 可對異源蛋白修飾

酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題。

昆蟲表達系統(tǒng)

高效表達,完善的加工修飾,易從無血清上清中純 化蛋白,無內(nèi)毒素

外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的 調(diào)控之下,由于病毒感染,細胞開始死亡, 無法進行連續(xù)性表達