●拿到質(zhì)粒,離心(3000r/min;2min)
●在質(zhì)粒中加入 TE(使質(zhì)粒最終加入到 110μL 感受態(tài)細胞中的量為 80-100ng,據(jù)此確定加入 TE 的量
●一般為(1μg 質(zhì)粒加 20μLTE;2μg 質(zhì)粒加 50μLTE;5μg 質(zhì)粒加 100μL TE)
●將質(zhì)粒與 TE 混勻,加入 2μL 混液于感受態(tài)細胞中
●將感受態(tài)細胞放入冰箱(4℃)中,30min
●取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激 90s,
●再次放入冰箱(4℃)中,3min
●拿出后取 200μL 的 LB 液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細胞中
●放入搖床(37℃; 195r) 中, 30nim 至 60min; (最佳 45min)
●取出離心(3000r/min;2min)
●去掉 200μL 的上清,留 100μL 左右上清懸浮沉淀,吸取 50μL 懸液涂平板,(先將對應(yīng)抗性的平板放入培養(yǎng)箱(37℃)中預(yù)熱 20min)
●把平板放入培養(yǎng)箱(37℃),過夜(12h 至 16h)
2、表達鑒定第二天的任務(wù),注意 Pcold 的表達溫度
●每個平板挑取單菌落至 4 支對應(yīng)抗性的 LB(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”
●將試管放入搖床(37℃;195r) 中,(單抗 3h 左右;雙抗 4 左右;剛開始用可見分光光度計測 OD 值; 熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)),測 OD 值(0.6 至 0.8)
●從“0”號管中取 700μL 懸液加入到 100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存
●在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入 2μL 的 IPTG(終濃度 0.5mM 最適)
●視不同的載體選擇適合的表達環(huán)境(PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達 6h;37℃表達 3h 至 4h(4 支試管,“0”“1”號試管 15℃表達過夜;“2”“3”試管 37℃表達 3h 至 4h)。Pcold:全部 15℃表達過夜)
3、表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度
●從每組 4 支的試管中均取 500μL 菌液加入到 1.5ml 離心管中,(若 OD 值不一樣,值小的可多取)離心
(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近)
●在每個離心管中加入 500μL 的 DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀
●在每支離心管中加入 45μL 的 1×PBS 和 45μL 的 2×Loading Buffer 懸浮沉淀(當溶質(zhì)適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質(zhì)多且粘稠時,應(yīng)使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量)
●放入煮樣器(100℃) 25min
●取出后離心(6000r/min) 3min, 電泳檢測。
質(zhì)粒載體:小型環(huán)狀 DNA,能自我復(fù)制。一個完整的質(zhì)粒載體必須要有復(fù)制起點、啟動子、插入的目的基因、篩選標記以及終止子;此外對大腸桿菌表達載體的要求是:①操縱子以及相應(yīng)的的調(diào)控序列,外源基因產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有毒害作用;②SD 序列,即核糖體識別序列,一般 SD 序列與起始密碼子之間間隔 7-13bp 翻譯效率最高;③多克隆位點以便目的基因插入到適合位置。
目的基因:在大腸桿菌表達體系中要表達的基因即外源基因,包括原核基因和真核基因;原核基因可以在大腸桿菌中直接表達出來,但是真核基因韓有內(nèi)含子不能,大腸桿菌不能對 mRNA 進行剪切,從而形成成熟的 mRNA,所以真核基因一般以 cDNA 的形式在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達。此外還需提供大腸桿菌能識別的且能轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因的元件。
表達宿主菌:表達蛋白的生物體即大腸桿菌。表達宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達過程中是很重要的因素——多數(shù)人會直接選擇實驗室曾經(jīng)用過的宿主菌,而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據(jù)宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性,例如目的蛋白需要形成二硫鍵,可以選擇 Origami 2 系列,Origami 能顯著提高細胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率,促進蛋白可溶性及活性表達;目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta 2 系列,補充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及 CGG)稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA,提高外源基因的表達水平。
大腸桿菌表達系統(tǒng)種類
T7 大腸桿菌表達系統(tǒng)
以 T7 啟動子、T7RNA 聚合酶等 T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系的元件為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng)。T7 RNA 聚合酶一種高活性的RNA 聚合酶,mRNA 的合成速度比大腸桿菌內(nèi)的 RNA 聚合酶快 5 倍,并某些不能被大腸桿菌 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄的序列也可以轉(zhuǎn)錄,所以 T7 RNA 聚合酶和 T7 噬箘體啟動子的存在的情況下,大腸桿菌本身的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7 噬箘體轉(zhuǎn)錄體系,最終受 T7 噬箘體啟動子控制基因的轉(zhuǎn)錄。
Lac 和 Tac 大腸桿菌表達系統(tǒng)
它是以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的大腸桿菌表達系統(tǒng),具有多順反子結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)排列為:
啟動子(lacP)- 操縱基因(lacO) - 結(jié)構(gòu)基因(lacZ-lacY-lacA)
原理:在無誘導(dǎo)物的情況下,負調(diào)節(jié)因子 lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合,阻止轉(zhuǎn)錄的起始。加入誘導(dǎo)劑后,IPTG 與 lacI 基因產(chǎn)物結(jié)合,使操縱基因解離出來,lac 操縱子的轉(zhuǎn)錄因此被激活。用 tac 啟動子構(gòu)建的表達系統(tǒng)稱為 Tac 表達系統(tǒng)。
PL 和 PR 大腸桿菌表達系統(tǒng)
以啟動子 PL、PR 為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng)。PL 和 PR 表達系統(tǒng)具有很強的啟動轉(zhuǎn)錄能力,誘導(dǎo)時不需要加入化學(xué)誘導(dǎo)劑,成本低廉,但在熱刺激過程中,大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會被激活,降解所表達的外源蛋白;其次是在 大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)菌體時,通過熱平衡交換方式提高溫度,需要較長的時間,這會降低誘導(dǎo)效果,從而對重組蛋白的表達量有影響。
此外還有其他表達系統(tǒng),如 pH 調(diào)控型、營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型等。
大腸桿菌表達系統(tǒng)比較
種類 | 優(yōu)點 | 缺點 |
T7 大腸桿菌表達系統(tǒng) | 目的基因的表達水平高 | 較高的本底表達 |
Lac 表達系統(tǒng) | 易于調(diào)控和操作 | 對表達和制備用于醫(yī)療的重組蛋白不適合 |
Tac 表達系統(tǒng) | 易于調(diào)控,轉(zhuǎn)錄水平高于 lac | 對表達和制備用于醫(yī)療的重組蛋白不適合 |
PL 和 PR 表達系統(tǒng) | PL 和 PR 表達系統(tǒng) | 可能降解所表達的重組蛋白,不適合大規(guī)模培養(yǎng) |
大腸桿菌與其他表達系統(tǒng)比較
表達系統(tǒng) | 優(yōu)點 | 缺點 |
大腸桿菌 | 大腸桿菌表達系統(tǒng)具有表達背景清楚,表達水平高, | 表達真核基因只能用其 cDNA,不能進 |
表達系統(tǒng) | 操作簡單,培養(yǎng)周期短,抗污染能力強 | 行翻譯后的修飾加工,含有大量內(nèi)毒素 |
哺乳動物 | 可以使蛋白正確折疊,提供復(fù)雜的 N 型糖基化和準 | 產(chǎn)率低,某些糖基化產(chǎn)物不穩(wěn)定、不易純 |
表達系統(tǒng) | 確的 O 型糖基化等加工修飾,更接近于天然蛋白 | 化,費用昂貴 |
酵母表達系統(tǒng) | 使用簡單,表達量高,可大規(guī)模生產(chǎn), | 酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題。 |
昆蟲表達系統(tǒng) | 高效表達,完善的加工修飾,易從無血清上清中純 化蛋白,無內(nèi)毒素 | 外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的 調(diào)控之下,由于病毒感染,細胞開始死亡, 無法進行連續(xù)性表達 |