酵母蛋白表達(dá)步驟/實(shí)驗(yàn)流程

本文主要講述了酵母蛋白表達(dá)步驟，詳細(xì)酵母表達(dá)流程。從感受態(tài)細(xì)胞制備，轉(zhuǎn)化方法選擇及操作，從化學(xué)試劑PEG1000 轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化三個(gè)方法入手及轉(zhuǎn)化子的篩選及最終的蛋白表達(dá)，全套酵母蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

質(zhì)粒線性化

在酵母表達(dá)系統(tǒng)中已經(jīng)介紹了酵母蛋白表達(dá)原理，因此線性化是酵母轉(zhuǎn)化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

轉(zhuǎn)化方法

畢赤酵母PEG1000 轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

配置緩沖液

1）緩沖液 A：1.0M 山梨醇，10mM 甘氨酸，pH8.35，3%（v/v）乙二醇，濾膜過(guò)濾，-20℃保存；

2）緩沖液 B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，濾膜過(guò)濾，-20℃保存；

3）緩沖液 C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，濾膜過(guò)濾，-20℃保存；

4）未污染的新鮮、試劑級(jí) DMSO，-70℃保存

將 DNA 直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源 DNA 的能力也在解凍過(guò)程中迅速下降；樣品的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行多組試驗(yàn)。

感受態(tài)制備
 

1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板（YPD：蛋白表達(dá)試劑配置），30℃培養(yǎng) 2 天；

2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過(guò)夜；

3）過(guò)夜培養(yǎng)后按 1%左右的接種量接種到 100mlYPD 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至 OD 值從 0.1 至 0.5~0.8；

4）3000~5000rpm 離心收集沉淀菌體，用 50ml 預(yù)冷 A 液洗滌，并重懸與 4mlA 液中；

5）根據(jù)每次使用量（0.1-0.2ml 左右）分裝與 1.5ml 離心管中，每管加入 10ul 的預(yù)冷 DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受態(tài)可以放到-80℃ ，但是酵母表達(dá)建議感受態(tài)現(xiàn)做現(xiàn)用）

酵母轉(zhuǎn)化

1）線性化質(zhì)粒 50ug（可預(yù)冷）溶于 200ul 的 TE 中，直接加入凍存的酵母感受態(tài)中；

2）37℃水浴 5min，過(guò)程混合樣品 2 次；

3）取出加入 1.5ml 緩沖液 B，徹底混勻；

4）30℃水浴 1 小時(shí)；

5）室溫 2000rpm 離心 10min，去上清，得沉淀，重懸菌體與 1.5ml 緩沖液 C 中；

6）再次離心，去上清，得沉淀，輕輕加入 0.2ml 緩沖液 C 重懸；

7）將重懸的轉(zhuǎn)化液涂與選擇性培養(yǎng)基（根據(jù)抗性配置）中，30℃孵育 3-4 天，進(jìn)行鑒定。

畢赤酵母電擊感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

感受態(tài)制備

1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板，30℃培養(yǎng) 2 天；

2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過(guò)夜；

3）過(guò)夜培養(yǎng)后按 1%左右的接種量接種到 100mlYPD 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至 OD 值 1.2~1.5；

4）4℃，5000rpm 離心 5min 收集沉淀菌體，用 100ml 預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體；

5）4℃，5000rpm 離心 10min 收集沉淀菌體，用 100ml 預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體；

6）再次 4℃，5000rpm 離心 10min 收集沉淀菌體，用 100ml 預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體；

7）20ml，1mol/L 山梨醇洗滌 1 次；

8）將菌體溶于 200ul，1mol/L 預(yù)冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置幾小時(shí)，待轉(zhuǎn)化

酵母電轉(zhuǎn)

1）準(zhǔn)備好 80ul 的酵母感受態(tài)與線性化的質(zhì)粒 1-5ug（冰上預(yù)冷 15min）混合，迅速放入 0.2cm 的電擊杯中（電擊杯冰上預(yù)冷滅菌），電擊；

2）電擊結(jié)束，迅速加入 1ml 山梨醇，涂平板（在搖床上培養(yǎng) 1h 后涂平板也可）；

3）MD 培養(yǎng)基生長(zhǎng) 3-4 天，ROB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 4-5 天后，鑒定。

電擊注意點(diǎn)

1）線性化質(zhì)粒的含量在 1-5ug，純度越高越好，量要有保證，很多人找不到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以考慮是否是這個(gè)因素造成；

2）感受態(tài)菌液收集，確定 OD 值在 1.2-1.5 之間，可以稀釋不同倍數(shù)，判斷是否是線性關(guān)系，菌液渾濁單 OD 值不高，可能是OD 稀釋倍數(shù)不夠；

3）感受態(tài)保存，感受態(tài)制備但其他還沒(méi)處理好，冰上放置的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有影響，因此還是那個(gè)原則：現(xiàn)做現(xiàn)用；且分裝成每次夠用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；                                       

4）電擊杯清洗，先洗凈吹干，浸泡在 75%乙醇中，使用前超凈臺(tái)紫外滅菌，重復(fù)使用對(duì)實(shí)驗(yàn)也會(huì)有一定影響；

5）電擊參數(shù)，電壓及電擊時(shí)間可以摸索，適當(dāng)增加電壓或延長(zhǎng)電擊時(shí)間，電擊過(guò)程冰上操作

畢赤酵母原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

原生質(zhì)轉(zhuǎn)化原理

酵母細(xì)胞具有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁會(huì)組織其對(duì)外源 DNA 的攝入，因此，去除掉部分的細(xì)胞壁有利于酵母細(xì)胞對(duì) DNA 的吸收。利用藤黃節(jié)桿菌酶（為一種葡聚糖酶），可以部分消化細(xì)胞壁。關(guān)鍵在于不能過(guò)度的消化細(xì)胞壁，否則將造成細(xì)胞死亡。藤黃節(jié)桿菌酶的消化能力受到 SDS 的影響，可以加入 SDS 對(duì)其消化進(jìn)行控制，以得到消化適度的細(xì)胞。消化獲得 70%的原生質(zhì)細(xì)胞時(shí)，效果最好。

試劑配制

轉(zhuǎn)化當(dāng)天，配制如下溶液：

① SE：1M 山梨醇，25mM EDTA，pH8.0

② SCE：SE：1M 山梨醇，1mM EDTA，10mM 檸檬酸鈉緩沖液，pH8.5

③ SOS：1M 山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl₂

④ CaS：1M 山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl₂

⑤ DTT，PEG：DTT 水配制為 1M 濃度，PEG 用水配制 40%（w/v）

⑥ CaT：20mM Tris pH7.5，20mM CaCl₂

⑦ 藤黃節(jié)桿菌酶：用水配制成 3mg/ml 的濃度

⑧ 5%SDS 溶液，RD 融化瓊脂 100ml，1M 山梨

醇每次轉(zhuǎn)化時(shí)配制

① SED：19ml LSE 加 1ml DTT

② PEG/Cat：1:1 混合 40%PEG 及Cat 其他試劑

① YPD 培養(yǎng)基 1L，YPD 平板 1L

② RDB 平板 1L，RDHB 平板 1L
 

感受態(tài)制備及消化細(xì)胞壁

1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板，30℃培養(yǎng) 2 天；

2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過(guò)夜；

3）取培養(yǎng)的細(xì)胞 5ul，10ul，20ul 分別加入到含有 200mlLYPD 的液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩過(guò)夜（300rpm）；

4）第二天測(cè)每個(gè)培養(yǎng)瓶中的 OD600 值，并取出事先配置好的轉(zhuǎn)化溶液，室溫放置：

5）收集 OD600 值在 0.2-0.3 對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，室溫離心（1500rpm5min 左右），得到沉淀；如果沒(méi)有培養(yǎng)瓶中的 OD 值在 0.3 左右的話，選擇一個(gè)培養(yǎng)瓶，用新配置的培養(yǎng)基以 1：4 稀釋，再次培養(yǎng)（2-3h 左右），直至出現(xiàn)OD 值為 0.2-0.3，收集細(xì)胞；

6）準(zhǔn)備去除細(xì)胞壁，準(zhǔn)備去壁試劑和待去壁的細(xì)胞；

7）準(zhǔn)備去壁試劑：現(xiàn)配 SED，保證DTT（分析級(jí)）的新鮮度，配完放-20℃；

8）準(zhǔn)備帶去壁細(xì)胞：先用滅菌水清洗，轉(zhuǎn)入離心管；1500rpm 離心 5min，收集細(xì)胞，用 20mlSED 重懸并洗滌離心；再次用 1M 山梨醇洗滌，離心（同上）；用SCE 重懸，分開至兩個(gè)離心管中（每管 10ml 左右）；

9）準(zhǔn)備藤黃節(jié)桿菌酶，取一管酶放置冰上，以上準(zhǔn)備的兩管細(xì)胞取出一管加入藤黃節(jié)桿菌酶，開始消化細(xì)胞（這一步可確定酶消化的最佳時(shí)間）；

最佳時(shí)間的確定

① 準(zhǔn)備 20ml 5%SDS 溶液分光光度計(jì)調(diào)至 800nm，空白對(duì)照為 800ul 5% SDS 及 200ul SCE；

② 準(zhǔn)備 10 個(gè)離心管，編號(hào)為 0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50（根據(jù)時(shí)間編號(hào)）；

③ 取上述 8 步中的另一管細(xì)胞，取出 200ul 加入至 0 號(hào)管中，放置冰上，此為 0 點(diǎn)；

④ 加入 7.5ul 藤黃節(jié)桿菌酶在剩余的細(xì)胞中，輕混，30℃孵育（不要晃動(dòng)）用來(lái)建立最佳時(shí)間所用

⑤ 2min 時(shí)取 200ul 懸浮液至 2 號(hào)管中，同理 4，5，6，7，8min 時(shí)重復(fù)操作，讀樣品 OD800 值；

⑥  用公式計(jì)算細(xì)胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T  時(shí)間  OD800-0  時(shí)間  OD800  值）x100} 10）

10）計(jì)算出去壁率為 70%左右時(shí)，得出最佳消化時(shí)間，同樣操作加入 7.5ul 消化酶于另一管中消化細(xì)胞
11）室溫離心去除懸浮液，1M 山梨醇洗滌一次，0.6mlCaS 懸浮細(xì)胞，立即轉(zhuǎn)化，去壁的細(xì)胞應(yīng)立即轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化畢赤酵母

1）取 100ul 將去壁細(xì)胞，放入 1.5ml 離心管中（滅菌）；

2）準(zhǔn)備 10ug 線性化質(zhì)粒（預(yù)冷）與去壁細(xì)胞混合，加入 1ml 新鮮 PEG/Cat 溶液，輕混，室溫孵育 10min；

3）室溫 750rpm 離心 10min，去除 PEG/Cat 溶液；并用 150ulSOS 培養(yǎng)基懸浮轉(zhuǎn)化細(xì)胞，室溫孵育 20min；

4）加入 800ul 1M 山梨醇，涂平板；

5）取 200ul 轉(zhuǎn)化細(xì)胞和 RD（液體）混勻倒于 RDB 平板上，凝固后導(dǎo)致平板，30℃培養(yǎng) 4-6 天，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子；

6）取 100ul 稀釋細(xì)胞，與 RDH（液體）混勻，涂在 RDHB 上，凝固后倒置生長(zhǎng)，30℃培養(yǎng) 4-6 天，出現(xiàn)克隆， 表明去壁細(xì)胞可再次生長(zhǎng)為分裂細(xì)胞。

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選與蛋白表達(dá)

Mut+和 Muts 表型的判斷
待轉(zhuǎn)化子在平板上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，進(jìn)行 Mut+和 Muts 的篩選。挑取單克隆，在 MM 及 MD 培養(yǎng)基上劃線或點(diǎn)（先在MM 平板上點(diǎn)，再在 MD 平板上點(diǎn)，一個(gè)克隆換一次牙簽），30℃培養(yǎng) 2 天。觀察，在MD 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在MM 培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或長(zhǎng)的很小即為 Muts 表型，其余為 Mut+表型。

Mut+的誘導(dǎo)表達(dá)

1）挑取單菌落，搖菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培養(yǎng)基中，30℃，300rpm 培養(yǎng)至 OD600 為 2-6（培養(yǎng)15-18h 左右觀察）；

2）室溫 2000rpm 離心 5min，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重懸，使 OD600 為 1.0 左右；將菌液至于 1L 搖瓶中，30℃300rpm 培養(yǎng)，每 24 小時(shí)加入 100%甲醇，至終濃度為 0.5-1.0%；

3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣（1ml）至于 1.5ml 離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間；

4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況。
 

Muts 的誘導(dǎo)表達(dá)

1）挑取單菌落，搖菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培養(yǎng)基中，30℃，300rpm 培養(yǎng)至 OD600 為 2-6（培養(yǎng)15-18h 左右觀察）；

2）室溫 2000rpm 離心 5min，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重懸，使 OD600 為 1.0 左右；將菌液至于 1L 搖瓶中，30℃300rpm 培養(yǎng)，每 24 小時(shí)加入 100%甲醇，至終濃度為 0.5-1.0%；

3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣（1ml）至于 1.5ml 離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間；

4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況。