多聚組氨酸標簽(His-tag)介紹及親和層析原理
固定化金屬離子親合層析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),簡稱金屬螯合親合層析,是一種新型的應用于原核蛋白純化的技術。該方法通過蛋白質表面的一些特殊的氨基酸,使之與金屬離子發(fā) 生相互作用,從而對蛋白質進行親和純化。這些作用包括配價鍵結合、靜電吸附、共價鍵結合等,其中以 6 個組氨酸殘基組合的融合標簽(His-Tag)在原核蛋白表達中的應用最為顯著。
His-Tag 可結合在目的蛋白的 C 末端或 N 末端,形成特殊的結構,以便于進行下一步的純化及檢測。由于金屬螯合親合層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點,所以可選擇范圍廣,高鹽,存在變性 劑以及去垢劑的上樣條件下進行純化,His-Tag 正逐漸成為分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一。
His-tag 作為蛋白純化時的首選標簽,其優(yōu)勢在于:
1. N-端的 His-Tag 與細菌的轉錄翻譯機制兼容,有利于蛋白表達;
2. 采用 IMAC(固定化金屬離子親合層析)純化 His-Tag 融合蛋白操作更加簡便;
3. His-Tag 對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響,不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學功能;
4. His-Tag 非常小,在融合蛋白結晶后對蛋白的結構沒有影響;His-Tag 的免疫原性相對較低,可將純化的蛋白直接注射入動物體內進行免疫并制備抗體;
5. 與其它親和標簽構建成雙親和標簽,并可應用于多種表達系統(tǒng);
His-Tag 融合蛋白的適用范圍也較廣,既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化,也可以在變性條件下進行純化。前者通常用來純化疏水性強的目的蛋白,而后者則通常純化包涵體蛋白。
His-Tag 親和層析填料
His-Tag 可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互作用,如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,F(xiàn)e3+等,其原理是利用蛋白質表面的特性,使之被吸附在凝膠柱上,從而達到分離純化蛋白的目的。
Ni2+在親和純化實驗中的使用最為廣泛。根據(jù)結合基團的不同,Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA 和Ni-NTA。Ni2+有六個螯合價位,其中 Ni-IDA 螯合了三價,Ni-NTA 螯合了四價。所以 IDA 的載量要比 NTA 的高,在同樣條件下 Ni-IDA 洗脫時的咪唑濃度也高于
Ni-NTA。但其弱的結合力使金屬離子在洗脫階段時很容 易浸出,與目的蛋白緊密結合,從而導致分離蛋白產量偏低,產品不純及金屬離子污染等問題。而 NTA 的顆粒粒度均勻,粒徑更小,并且螯合鎳更穩(wěn)定,能耐受較高的還原劑,使填料更加穩(wěn)定,鎳離子不易脫落。
IMAC 在通常的情況下是比較穩(wěn)定的,但螯合劑的存在則會導致其金屬離子脫落。例如在 E.coli 的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑,如在三羧酸循環(huán)中產生了二羧酸類物質。因此,E.coli 在某些高壓情況下就會產生高特異性的金屬螯合劑(通常存在于細菌的細胞周質中),導致 His-Tag 融合蛋白純化的純度和產量大大降低。所以在進行純化 His-Tag 融合蛋白的實驗時,首先需要去除螯合劑。
Ni-NTA 親和層析實驗
Ni-NTA 分離帶 His 標簽的重組蛋白
1. Ni-NTA 裝柱,1.6×20cm,柱床體積為 10mL;
2. 用緩沖液 1 平衡 2~5 個床體積,流速為 2mL/min;
3. 將 20mL 細胞破碎液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45μm 濾膜過濾,上樣,流速為 1mL/min;
4. 用緩沖液 1 再洗 2~5 個床體積,流速為 2mL/min;
5. 用分別含 10、20、50、100、200、300、400mM 咪唑的緩沖液 3 進行階段洗脫,流速為 2mL/min,收集各階段洗脫峰,用 SDS-PAGE 檢測融合蛋白的分子量大小和純度;
6. 用純水流洗 5 個柱床體積,再用 20%的乙醇流洗 3 個柱床體積,流速為 2mL/min,柱子置于低溫環(huán)境中保存。
緩沖液組成:
緩沖液 1
50mM pH7.4 的 PBS 緩沖液。配制:0.5M NaH2PO4 19mL,0.5M Na2HPO4 81mL,NaCl 29.3g, 加適量水溶解后定容到 1000mL。
緩沖液 2
50mM 磷酸鹽緩沖液,pH7.4,即 pH7.4 的 PBS 溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19mL,0.5M Na2HPO4 81mL, NaCl 29.3g 和咪唑 34g, 加適量水,調 pH 后定容到 1000mL。
緩沖液 3
不同咪唑濃度的緩沖液 B 配制:
咪唑濃度 | 緩沖液 1 量(mL) | 緩沖液 2 量(mL) |
10mM | 98 | 2 |
50mM | 90 | 10 |
100mM | 80 | 20 |
200mM | 60 | 40 |
300mM | 40 | 60 |
400mM | 20 | 80 |
咪唑洗脫原理
Ni 柱中的氯化鎳可以與有 His-Tag 的融合蛋白結合,也可以與咪唑進行結合,當標簽蛋白與層析柱表面珠孔內的鎳離子介質發(fā)生結合時,不同濃度的咪唑通過層析柱,就會將與鎳配位的標簽蛋白,雜蛋白等分別洗脫下來,從而得到高純度目標蛋白。
附錄:Ni-IDA 和Ni-NTA 的一些參數(shù)對比
名稱 | Ni-IDA | Ni-NTA |
參數(shù) | 指標 | |
基質 | 6%交聯(lián)瓊脂糖凝膠 | |
配基 | 亞胺二乙酸(IDA) | 次氮基三乙酸(NTA) |
粒徑 | 45~165 μm | 60~169 μm |
金屬離子密度 | 40 μmol/mL | 20-40 μmol/mL |
載量 | 25-30mg 蛋白/mL | 15mg 蛋白/mL |
柱體積 | 1mL 或 5mL | 1mL 或 5mL |
柱尺寸(內徑 x 高度) | 0.9x1.57cm(1mL 柱子) 0.9x1.57cm(5mL 柱子) | 0.6cmx2.8cm(1mL 柱子) 1.4cmx2.98cm(5mL 柱子)
|
推薦流速 | mL/min(1mL 柱子) 5mL/min(5mL 柱子) | |
最高流速 | 4mL/min(1mL 柱子) | 20mL/min(5mL 柱子) |
最高耐壓 | 0.3MPa(3bar) | 0.5MPa(5bar) >20mM 硫化試劑 |
避免使用的試劑 | 0.3MPa(3bar) | 0.5MPa(5bar) >20mM 硫化試劑 >10mM DTT |
避免使用的試劑 | 螯合劑:EDTA、EGTA、檸檬酸等 | 螯合劑:EDTA、EGTA |
pH 穩(wěn)定性 | PH 2-14(短期,2h);PH 3-12(長期,7 天) |