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                                       ExpiCHO-S細(xì)胞F1電轉(zhuǎn)瞬時表達(dá)載體實驗方案

實驗準(zhǔn)備階段

實驗準(zhǔn)備

雙方按照表1進(jìn)行實驗所需儀器及耗材準(zhǔn)備。

表1：實驗所需試劑耗材

2、實驗準(zhǔn)備

2.1細(xì)胞準(zhǔn)備：ExpiCHO-S細(xì)胞

由客戶提供的ExpiCHO-S細(xì)胞，以2-3×10⁵/ml的密度進(jìn)行接種培養(yǎng)，約72h（3天）后收集細(xì)胞（此時細(xì)胞密度約為4-6×10⁶），進(jìn)行傳代處理（傳3代后）進(jìn)行細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實驗。

為保持電轉(zhuǎn)穩(wěn)定性，建議：

①傳代后24-72h內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，建議初始凍存細(xì)胞株復(fù)蘇后傳代3代及以上再進(jìn)行電轉(zhuǎn)染；

②電轉(zhuǎn)前細(xì)胞密度建議3-6*10^⁶/ml，最高不超過8*10^⁶/ml，細(xì)胞活率：95%以上；

③細(xì)胞代數(shù)不宜過短與過長，目前做過3-15代內(nèi)，蛋白表達(dá)均比較穩(wěn)定。

細(xì)胞培養(yǎng)條件：37°C，8%CO₂，80%以上濕度，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速120rpm，振幅25mm

2.2 質(zhì)粒準(zhǔn)備

質(zhì)粒包含客戶提供的質(zhì)粒A（lc、hc）；質(zhì)粒B（lc、hc）。

質(zhì)粒要求：大提后，以滅菌后的超純水溶解（質(zhì)粒濃度須大于1μg/μl），不含TE、EDTA等螯合劑；去內(nèi)毒素: 10EU/ml以下；A260/A280:1.8-2.0；瓊脂糖凝膠電泳檢質(zhì)粒條帶清晰無雜帶，以超螺旋帶亮度是線性的1.5-2倍普通條帶最佳。

實驗方案及結(jié)果

H1質(zhì)檢細(xì)胞狀態(tài)方案(略)

本方案不涉及H1質(zhì)檢，因而略過。

2.F1電轉(zhuǎn)實驗方案

EBXP-F1流式電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行大體積電轉(zhuǎn)體系為：1×10⁸//100μg/ml，具體電轉(zhuǎn)參數(shù)見表3；細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，需置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置孵育20min，取樣進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計數(shù)，以4×10⁶/ml的活細(xì)胞密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并1：100 添加丁酸鈉（NaBu），37°C，8%CO₂ 培養(yǎng)箱內(nèi)搖床培養(yǎng)；電轉(zhuǎn)后24h，按要求添加補(bǔ)料，并將細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移到32°C，8%CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，d3、d5再次添加補(bǔ)料。具體電轉(zhuǎn)后處理方式，詳見表4。

 表3   ExpiCHO-S細(xì)胞電轉(zhuǎn)抗體表達(dá)載體參數(shù)

備注：本輪實驗培養(yǎng)電轉(zhuǎn)后，客戶電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)總體積大約XX ml×4×10⁶/ml(具體按照細(xì)胞實際得率而定)。 

按照表4進(jìn)行添加補(bǔ)料，電轉(zhuǎn)后37°C培養(yǎng)，24h后轉(zhuǎn)移至32°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

為了更好的監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，以及抗體積累趨勢，建議D3開始每天進(jìn)行細(xì)胞密度和活率監(jiān)測，并留樣品進(jìn)行蛋白檢測。如有條件，可以同時監(jiān)測細(xì)胞葡萄糖含量以及乳酸代謝。ExpiCHO-S細(xì)胞活率低于70%以下，建議離心獲得蛋白樣品。

表4  ExpiCHO-S細(xì)胞F1電轉(zhuǎn)補(bǔ)料方案

注：表4中培養(yǎng)體積僅為預(yù)判體積，實際培養(yǎng)體積由電轉(zhuǎn)后活細(xì)胞實際得率而定。以上補(bǔ)料添加時間段參考壹達(dá)補(bǔ)料方案。

電轉(zhuǎn)后24h，壹達(dá)實驗組即d1天開始添加客戶補(bǔ)料，電轉(zhuǎn)后24h轉(zhuǎn)移至32°C搖床培養(yǎng)；且在d3和d5天按照d1方式再加入補(bǔ)料培養(yǎng)；d1-d7培養(yǎng)過程中，均需取樣進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計數(shù)，并收集1ml細(xì)胞懸液，12000rpm 5min離心獲得蛋白樣品。

三、實驗步驟（參見壹達(dá)SOP《 RD-WI-02-045 懸浮型CHO-S細(xì)胞F1電轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)操作流程A0》）

1、開機(jī)檢測與設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)：打開F1的電源鍵及開關(guān)鍵，儀器自檢無誤后，設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)，電壓200V，脈寬2000μs，電極次數(shù)4.5次，時間間隔611ms，流速4.71ml/min，設(shè)置搖擺，備用。

2、細(xì)胞觀察：從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞搖瓶，立即取出100μl于96孔板中靜置5min觀察細(xì)胞形態(tài)，是否污染。（主要判斷是否污染）

3、細(xì)胞計數(shù)：將細(xì)胞搖瓶用10ml移液器吹打混勻5次，取100μl細(xì)胞懸液加入100μl或者200μl 1× PBS稀釋混勻，取10μl的細(xì)胞原液加入10μl 臺盼藍(lán)染色，即1：4或1：6稀釋，混勻靜置3min，取10μl使用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。若有儀器直接按照儀器計數(shù)方法進(jìn)行。

4、收集細(xì)胞、離心棄去培養(yǎng)基：取所需數(shù)量細(xì)胞，移至離心管內(nèi)300g，5min進(jìn)行離心，棄上清。（如Eppendorf離心機(jī)50ml適配器，盡可能的去除培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)基導(dǎo)電性過高，殘留較多會影響電轉(zhuǎn)Buffer的導(dǎo)電性，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。）

5、DNA、細(xì)胞、buffer混合：使用移液器棄去上清，加入相應(yīng)體積的EL buffer(如計劃電轉(zhuǎn)7ml，則加入7ml EBEL buffer )，再加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒，使用移液器吹打10-12次使得質(zhì)粒、buffer、細(xì)胞完全混勻；注意移液器吹打細(xì)胞過程中，切忌產(chǎn)生大量氣泡，如果不小心產(chǎn)生大量氣泡，請將不含氣泡的液體轉(zhuǎn)移至新的離心管中或者用移液器小心吸去氣泡，連接F1電極耗材。（若質(zhì)粒來源不清楚，建議加質(zhì)粒加入到buffer液中，通過0.22μm濾膜過濾，然后再加入到細(xì)胞中，以保證無菌。）

6、安裝電極：按照以下示意圖將電轉(zhuǎn)耗材由左到右安裝至電轉(zhuǎn)儀相應(yīng)位置；

（安裝耗材時按照下圖方式進(jìn)行連接。濾器位置不宜太靠僅黑色面板，以防電轉(zhuǎn)過程中，搖擺導(dǎo)致刮花面板。）

注意液位感應(yīng)處上下兩個膠粒固定好位置；注意蠕動泵左右兩個膠粒固定好位置

7、核對參數(shù)、電轉(zhuǎn)：核對電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓200V，脈寬2000μs，電極次數(shù)4.5次，時間間隔611ms，流速4.71ml/min，開始電擊。

8、處理耗材：電轉(zhuǎn)后從右至左依次取下電轉(zhuǎn)耗材，將耗材表面噴灑精處理后，移至生物安全柜，將收集管用自身的管蓋擰緊。

9、孵育：將收集管置于37℃培養(yǎng)箱靜置孵育20min。（若收樣的離心管中還有空間，可添加適量CD04完全培養(yǎng)基后進(jìn)行孵育，不要吹打混勻；如7ml收樣體積+5mlCD04培養(yǎng)基孵育。此步驟要輕柔，電轉(zhuǎn)后細(xì)胞比較脆弱。）

10、接種處理：孵育完成后，取出收集管，將細(xì)胞吹打均勻，臺盼藍(lán)染色計數(shù)（若電轉(zhuǎn)密度為1×10⁸/ml，建議至少稀釋40倍），以活細(xì)胞密度為4×10⁶/ml進(jìn)行接種培養(yǎng)。

（一般電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞得率在60-80%之間，如5*10^⁸細(xì)胞總量，電轉(zhuǎn)后實際細(xì)胞量可能在3.0-4.0*10^⁸，預(yù)判細(xì)胞培養(yǎng)體積為75-100ml；因此可以將上述收樣管中細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移至70ml培養(yǎng)體積中，再進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。最后根據(jù)4*10^⁶密度補(bǔ)足培養(yǎng)體積即可。）

11、細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1mM NaBu，置于37℃ 8%CO₂培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)，并在24h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（除了添加Nabu，CD04培養(yǎng)基需要添加4mM谷氨酰胺。）

12、補(bǔ)料添加：在電轉(zhuǎn)后的第1、3、5天按照5% 2×103A+1% BR7添加補(bǔ)料。（若細(xì)胞需要培養(yǎng)更長時間，可在第7、9天按照7.5% 2×103A+1% BR7進(jìn)行添加，在第11天按照5% 2×103A+1% BR7添加補(bǔ)料）。

（電轉(zhuǎn)后24h，即D1開始需要持續(xù)降溫培養(yǎng)32°C，8%CO₂，同時添加補(bǔ)料。建議D1開始監(jiān)測葡萄糖含量以及乳酸代謝；D3開始監(jiān)測細(xì)胞密度與活率；D5開始每天留樣。）

四、實驗結(jié)果

（用于結(jié)果跟進(jìn)記錄，不限定具體形式/格式）

備注：

ExpiCHO-S細(xì)胞復(fù)蘇步驟：

1、從液氮中取出細(xì)胞，在37℃的水浴中旋轉(zhuǎn)融化1-2min，迅速融化細(xì)胞，直到只剩下少量的冰。不要將細(xì)胞管浸入水中。

2、在細(xì)胞完全解凍之前，先用70%乙醇擦拭管子，然后在超凈臺中打開。

3、可以預(yù)準(zhǔn)備9ml培養(yǎng)基，然后將融化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其中，混勻后臺盼藍(lán)染色計數(shù)，以活細(xì)胞密度3e5/ml接種。

Note：1E7/支細(xì)胞株根據(jù)細(xì)胞得率一般可以培養(yǎng)25-30ml。

4、將細(xì)胞置于37℃，濕度 ≥ 80%，8% CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

Note：搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為125±5rpm，振幅設(shè)為19mm；轉(zhuǎn)速120±5rpm時，振幅為25mm；轉(zhuǎn)速為95±5rpm時，振幅為 50mm。

5、復(fù)蘇后第三天，測定細(xì)胞密度以及存活率，細(xì)胞存活率應(yīng) ≥ 90%，后續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞活率恢復(fù)至95%以上。

6、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×10⁶-6×10⁶/ml時，將細(xì)胞傳代（一般在復(fù)蘇后3-4天）

二、電轉(zhuǎn)前客戶細(xì)胞準(zhǔn)備階段：

2.1 ExpiCHO-S?表達(dá)培養(yǎng)基培養(yǎng)要求：

①ExpiCHO-S? 細(xì)胞可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，細(xì)胞倍增時間：17-18h。

②該細(xì)胞具有廣泛的細(xì)胞對數(shù)期（4×10⁶-15×10⁶/ml），對數(shù)期細(xì)胞活力應(yīng)保持在95%以上，此外，該細(xì)胞的最高培養(yǎng)密度可達(dá)到20×10⁶/ml。

上圖摘自ExpiCHO-S細(xì)胞培養(yǎng)說明書

③建議活細(xì)胞初始接種密度保持在0.2×10⁶-0.3×10⁶/ml，可保持3天的培養(yǎng)時間，密度大概達(dá)到4×10⁶-6×10⁶/ml時，再將細(xì)胞傳代。

活細(xì)胞初始接種密度保持在0.15×10⁶-0.2×10⁶/ml，可保持4天的培養(yǎng)時間，密度大概達(dá)到4×10⁶-6×10⁶/ml時，再將細(xì)胞傳代。

建議細(xì)胞密度達(dá)到4×10⁶-6×10⁶/ml時，再將細(xì)胞傳代。（電轉(zhuǎn)前細(xì)胞密度建議同樣保持4×10⁶-6×10⁶/ml，細(xì)胞活力95%以上）

④培養(yǎng)箱條件：將細(xì)胞置于37°C，濕度≥ 80%，8% CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

Note：搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為125±5rpm，振幅設(shè)為19mm；轉(zhuǎn)速120±5rpm時，振幅為25mm；轉(zhuǎn)速為95±5rpm時，振幅為50mm。

Note：如果細(xì)胞傳代密度在早期對數(shù)生長周期之外，可能會導(dǎo)致細(xì)胞倍增周期延長以及更低的滴度。調(diào)整初始接種密度從而使細(xì)胞在傳代時的密度為4×10⁶-6×10⁶/ml。

Note：對于常規(guī)的在125ml-2L 培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為125±5rpm，振幅為19mm；轉(zhuǎn)速120±5rpm時，振幅為25mm；轉(zhuǎn)速為95±5rpm時，振幅為50mm。

Note：對于3L的培養(yǎng)瓶，設(shè)置轉(zhuǎn)速為90±5 rpm，振幅為19mm，轉(zhuǎn)速為85±5rpm時，振幅為25mm，轉(zhuǎn)速為80±5rpm時，振幅為50mm。

2.2 國產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)要求：

①若客戶僅用國產(chǎn)培養(yǎng)基，進(jìn)行ExpiCHO-S細(xì)胞傳代培養(yǎng)，建議初始接種密度0.3-0.5×10⁶，可維持2-3天的培養(yǎng)時間，細(xì)胞密度建議不超過6×10⁶/ml，再將細(xì)胞傳代。（電轉(zhuǎn)前細(xì)胞密度建議同樣保持3-6×10⁶/ml，細(xì)胞活力95%以上）

②細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)參數(shù)，以及轉(zhuǎn)速，振幅等同樣參考上述ExpiCHO說明書中要求。

2、電轉(zhuǎn)后實驗準(zhǔn)備階段：

電轉(zhuǎn)后無論ExpiCHO表達(dá)培養(yǎng)基或是國產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)的ExpiCHO-S細(xì)胞，均要求4×10⁶/ml密度進(jìn)行培養(yǎng)，D0添加丁酸鈉抑制劑；D1、D3、D5……間隔添加補(bǔ)料，且根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)一般建議D7-D10進(jìn)行細(xì)胞收養(yǎng)檢測蛋白量，期間不用再添加培養(yǎng)基。