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多聚組氨酸標(biāo)簽（His-tag）介紹及親和層析原理

       固定化金屬離子親合層析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），簡稱金屬螯合親合層析，是一種新型的應(yīng)用于原核蛋白純化的技術(shù)。該方法通過蛋白質(zhì)表面的一些特殊的氨基酸，使之與金屬離子發(fā)      生相互作用，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化。這些作用包括配價(jià)鍵結(jié)合、靜電吸附、共價(jià)鍵結(jié)合等，其中以 6 個(gè)組氨酸殘基組合的融合標(biāo)簽（His-Tag）在原核蛋白表達(dá)中的應(yīng)用最為顯著。

       His-Tag 可結(jié)合在目的蛋白的 C 末端或 N 末端，形成特殊的結(jié)構(gòu)，以便于進(jìn)行下一步的純化及檢測(cè)。由于金屬螯合親合層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以可選擇范圍廣，高鹽，存在變性      劑以及去垢劑的上樣條件下進(jìn)行純化，His-Tag 正逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術(shù)之一。

His-tag 作為蛋白純化時(shí)的首選標(biāo)簽，其優(yōu)勢(shì)在于：
1. N-端的 His-Tag 與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；
2. 采用 IMAC（固定化金屬離子親合層析）純化 His-Tag 融合蛋白操作更加簡便；
3. His-Tag 對(duì)目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，不會(huì)改變目的蛋白本身的可溶性和生物學(xué)功能；
4. His-Tag 非常小，在融合蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響；His-Tag 的免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫并制備抗體；
5. 與其它親和標(biāo)簽構(gòu)建成雙親和標(biāo)簽，并可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)；
        His-Tag 融合蛋白的適用范圍也較廣，既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進(jìn)行純化。前者通常用來純化疏水性強(qiáng)的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白。

His-Tag 親和層析填料
His-Tag 可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，F(xiàn)e3+等，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的特性，使之被吸附在凝膠柱上，從而達(dá)到分離純化蛋白的目的。

Ni2+在親和純化實(shí)驗(yàn)中的使用最為廣泛。根據(jù)結(jié)合基團(tuán)的不同，Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA 和Ni-NTA。Ni2+有六個(gè)螯合價(jià)位，其中 Ni-IDA 螯合了三價(jià)，Ni-NTA 螯合了四價(jià)。所以 IDA 的載量要比 NTA 的高，在同樣條件下 Ni-IDA 洗脫時(shí)的咪唑濃度也高于

Ni-NTA。但其弱的結(jié)合力使金屬離子在洗脫階段時(shí)很容 易浸出，與目的蛋白緊密結(jié)合，從而導(dǎo)致分離蛋白產(chǎn)量偏低，產(chǎn)品不純及金屬離子污染等問題。而 NTA 的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落。

IMAC 在通常的情況下是比較穩(wěn)定的，但螯合劑的存在則會(huì)導(dǎo)致其金屬離子脫落。例如在 E.coli 的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑，如在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生了二羧酸類物質(zhì)。因此，E.coli 在某些高壓情況下就會(huì)產(chǎn)生高特異性的金屬螯合劑（通常存在于細(xì)菌的細(xì)胞周質(zhì)中），導(dǎo)致 His-Tag 融合蛋白純化的純度和產(chǎn)量大大降低。所以在進(jìn)行純化 His-Tag 融合蛋白的實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要去除螯合劑。

Ni-NTA 親和層析實(shí)驗(yàn)
Ni-NTA 分離帶 His 標(biāo)簽的重組蛋白

1. Ni-NTA 裝柱，1.6×20cm，柱床體積為 10mL；
2. 用緩沖液 1 平衡 2~5 個(gè)床體積，流速為 2mL/min；
3. 將 20mL 細(xì)胞破碎液（50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl）0.45μm 濾膜過濾，上樣，流速為 1mL/min；
4. 用緩沖液 1 再洗 2~5 個(gè)床體積，流速為 2mL/min；
5. 用分別含 10、20、50、100、200、300、400mM 咪唑的緩沖液 3 進(jìn)行階段洗脫，流速為 2mL/min，收集各階段洗脫峰，用 SDS-PAGE 檢測(cè)融合蛋白的分子量大小和純度；
6. 用純水流洗 5 個(gè)柱床體積，再用 20%的乙醇流洗 3 個(gè)柱床體積，流速為 2mL/min，柱子置于低溫環(huán)境中保存。

緩沖液組成：
緩沖液 1

50mM pH7.4 的 PBS 緩沖液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19mL，0.5M Na₂HPO₄ 81mL，NaCl 29.3g， 加適量水溶解后定容到 1000mL。
緩沖液 2

50mM 磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即 pH7.4 的 PBS 溶液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19mL，0.5M Na₂HPO₄ 81mL， NaCl 29.3g 和咪唑 34g, 加適量水，調(diào) pH 后定容到 1000mL。
緩沖液 3

不同咪唑濃度的緩沖液 B 配制：

咪唑洗脫原理
Ni 柱中的氯化鎳可以與有 His-Tag 的融合蛋白結(jié)合，也可以與咪唑進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)標(biāo)簽蛋白與層析柱表面珠孔內(nèi)的鎳離子介質(zhì)發(fā)生結(jié)合時(shí)，不同濃度的咪唑通過層析柱，就會(huì)將與鎳配位的標(biāo)簽蛋白，雜蛋白等分別洗脫下來，從而得到高純度目標(biāo)蛋白。

附錄：Ni-IDA 和Ni-NTA 的一些參數(shù)對(duì)比