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《項(xiàng)目方案評估》

1. 蛋白序列

CRT：蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)RCSB PDBID：3POS

A VYFKEQFLDG DGWTSRWIES KHKSDFGKFV LSSGKFYGDE EKDKGLQTSQ DARFYALSAS FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE QNIDCGGGYV KLFPNSLDQT DMHGDSEYNI MFGPDICGPG TKKVHVIFNY KGKNVLINKD IRCKDDEFTH LYLIVRPDN TYEVKIDNSQ VES

IGG：蛋白晶體結(jié)構(gòu)2DLF、1WZQ、1GLC，此處挑選2DLF

2. 對接位點(diǎn)分析

根據(jù)文獻(xiàn)報道并結(jié)合模板蛋白晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用預(yù)估分析，整理其可能相互作用的結(jié)合模式。

在以下文獻(xiàn)中對該蛋白所屬6類亞型蛋白進(jìn)行了序列比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列特別是binding domain存在著極高的序列相似性，高達(dá)95%以上，說明該蛋白結(jié)合槽位置高度保守，這一推論表明我們所研究的蛋白質(zhì)在“結(jié)構(gòu)組成”和“結(jié)合模式”上都是較為統(tǒng)一。

因此，該文獻(xiàn)具有相對較為可靠的參考價值，參照本文獻(xiàn)可以進(jìn)行相似方法的蛋白分析。

3. 蛋白蛋白對接

結(jié)合已有相關(guān)資料與蛋白對接軟件Rossetta，對蛋白質(zhì)多聚體進(jìn)行構(gòu)建。

? 蛋白蛋白對接一直是分子模擬中非常重要同時非常難解決的話題，相較于小分子蛋白之間的聯(lián)系，蛋白蛋白對接如今更加不成熟，在蛋白蛋白對接之前，最好能夠搜集更多的文獻(xiàn)進(jìn)行支持，讓模擬的結(jié)果不空洞，才能保證對接的準(zhǔn)確性。
 

蛋白蛋白對接如今比較著名的軟件有Hex Protein Docking，ZDock，rDock，以及Rosetta等等。其中Hex Protein Docking雖算法比較復(fù)雜，但沒有評分功能（PS：可能是我沒有找到···），ZDock一般作為前期的初對接，rDock為ZDock的升級算法，一般將ZDock對接后的前幾個得分構(gòu)象使用rDock進(jìn)行進(jìn)一步對接。但是Hex Protein Docking，ZDock和rDock對接方法，目前均處于低級對接階段，對接結(jié)果基本不可信，特別是本文中的大體系跨膜蛋白分子對接項(xiàng)目。
 

Rosetta對接軟件，是由加州大學(xué)舊金山分校著名晶體結(jié)構(gòu)物理學(xué)家David Baker及其項(xiàng)目組所開發(fā)研究，進(jìn)展使接近原子精度的蛋白質(zhì)預(yù)測和設(shè)計成為可能。這一軟件，基于高精度高計算效率的全原子能量函數(shù)和用于搜索極端崎嶇勢能面的有效采樣策略的開發(fā)，這兩者都由結(jié)構(gòu)預(yù)測和設(shè)計的測試結(jié)果的反饋所推動。Rosetta程序中統(tǒng)一的能量和運(yùn)動框架可廣泛用于大分子建模的問題中，從微纖結(jié)構(gòu)預(yù)測到RNA折疊再到設(shè)計新的蛋白質(zhì)界面，都易于進(jìn)行研究和突出區(qū)域的改進(jìn)設(shè)計。其對接結(jié)果相較于Hex Protein Docking，ZDock和rDock等幾個軟件，有著極大的提升與可靠性。

Rosetta中進(jìn)行對接包含兩個步驟。第一步，進(jìn)行積極（aggresive）采樣，方法使用的質(zhì)心模型。第二步采用全原子模型進(jìn)行小范圍的優(yōu)化。
 

Rosetta軟件最早是在華盛頓大學(xué)David Baker教授實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的，目前軟件內(nèi)有多個應(yīng)用可供用戶使用，常用的應(yīng)用程序有同源建模（comparative modelling）、短片段模擬與重建（Loop modelling and rebuilding）、蛋白質(zhì)設(shè)計（protein design）、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)對接（Protein-protein docking）、蛋白質(zhì)配體對接（Protein-ligand docking）等。Rosetta軟件對于學(xué)術(shù)界用戶是免費(fèi)的，只需要申請獲得一個許可證，就可以從Rosetta的官網(wǎng)中下載軟件了。

3.1 Rosetta對接結(jié)果挑選

利用Rosetta軟件共對接出10000中蛋白相互作用位相。利用Rosetta自帶聚類分析模塊進(jìn)行聚類分析并根據(jù)分子對接能量打分進(jìn)行排名。其中位置比較靠譜，能量打分較好的前10位蛋白質(zhì)對接能量如下：

我們?nèi)∑渲心芰孔詈玫慕Y(jié)構(gòu)Conformation 1 (-265.1Kcal/mol)進(jìn)行后續(xù)分析。

4. 蛋白分子動力學(xué)優(yōu)化

經(jīng)過結(jié)構(gòu)疊合與補(bǔ)齊，并對構(gòu)象蛋白質(zhì)進(jìn)行6ns分子動力學(xué)優(yōu)化，直至結(jié)構(gòu)平衡。

6.1 方法

選取最優(yōu)構(gòu)象，用AMBER14軟件做分子動力學(xué)模擬。整個蛋白體系都采用gaff和ff14SB力場，以蛋白為中心，加10A的立方水盒子，加Na+使體系呈電中性，保存拓?fù)浜妥鴺?biāo)結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行模擬，模擬流程如下：

（1）兩步能量最小化，先限制蛋白，最小化水分子的能量，然后放開蛋白，整個體系的能量最小化。第一次能量最小化一共5000次循環(huán)，先采用最速下降法做1500次循環(huán)，第二次能量最小化一共5000次循環(huán)，先采用最速下降法做了2000次循環(huán)。

（2）體系平衡，首先是體系的升溫平衡過程，采用郎之萬控溫方法平衡了100ps。 然后進(jìn)行升壓平衡過程，一共平衡了100ps，采用了各向同性的 Berendsen 控壓方法。

（3）動力學(xué)模擬，無限制自由模擬階段?？販乜貕悍椒ㄅc前一階段相同，范德華能和短程靜電能的截斷距離為10?，采用PME方法計算長程靜電能。
 

6.2 結(jié)果分析

6.2.1  RMSD值分析

對該蛋白進(jìn)行4次分子動力學(xué)優(yōu)化，從四個體系骨架原子的均方根波動值（RMSD值）可以看出，在2ns后，四個體系RMSD值的波動都小于0.5A，均已經(jīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，可以用來結(jié)構(gòu)分析。說明該蛋白質(zhì)，無論始發(fā)點(diǎn)出于什么狀態(tài)，初始參數(shù)均能使蛋白質(zhì)得到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并達(dá)到較好的平均結(jié)構(gòu)狀態(tài)。

4次體系隨時間變化的RMSD值

取出平均結(jié)構(gòu)進(jìn)行后續(xù)分析，得到的平均結(jié)構(gòu)如下：