Fret 熒光共振能量轉(zhuǎn)移
對于分子生物學來講,生物分析手段的發(fā)展,是闡明機理的必要條件。在研究分子間相互作用的道路上,人們不斷 探索,總結(jié)出很多方法,免疫技術(shù),晶體衍射,核磁共振等。1948 年,熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)理論被首次提出,它可以測定 1.0-6.0nm 距離內(nèi)分子間的相互作用。1967 年,這一理論得到了實驗驗證,將 1.0-6.0nm 的距離稱為光學尺。二十世紀八十年代出,通過科學家的不斷探索,F(xiàn)ret 技術(shù)成功運用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中。自 Fret 熒光共振能量技術(shù)誕生以來,已結(jié)合多種先進的技術(shù)和方法,如電子顯微鏡,X 射線衍射等,推動了分子生物學檢測手段的發(fā)展。
作用原理
熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù),是采用物理方法去檢測分子間的相互作用的方法。 他適用于在細胞正常的生理條件下,驗證已知分子間是否存在相互作用。此方法的檢測原理如下;
將我們要檢測的蛋白(如圖 X 和Y),分別偶聯(lián)上 D 和A 熒光蛋白,D 和A 是一對熒光物質(zhì),我們稱之為供體(donor)和受體(acceptor)。當用 430nm 的紫光去激發(fā) X 融合蛋白時,它能夠產(chǎn)生 490nm 的藍色熒光;同樣,當我們用 490nm 的藍光去激發(fā) Y 融合蛋白時,它能夠產(chǎn)生 530nm 的黃色熒光。(結(jié)合圖 1) 。
當?shù)鞍?X 和 Y 間沒有相互作用時(兩者的空間距離>10nm),融合蛋白 X 和 Y 分別產(chǎn)生相應(yīng)的熒光而被檢測到,如果蛋白 X 和 Y 間存在相互作用(兩者的空間距離需<10nm,結(jié)合圖 2),用紫光激發(fā)融合蛋白 X 其產(chǎn)生的藍光會被融合蛋白Y 吸收,從而產(chǎn)生黃色熒光,這時,在細胞內(nèi)將檢測不到藍色熒光的存在。這時因為能量從 X 融合蛋白轉(zhuǎn)移到了 Y 融合蛋白,這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。
技術(shù)難點
一個理想的 Fret 相互作用體系,要求要有一對合適的熒光物質(zhì), 即供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有明顯的重疊。且當供體的激發(fā)波長時對受體無影響,供體和受體的發(fā)射光譜要完全分開,否則容易造成光譜干涉,而使反應(yīng) 體系不穩(wěn)定。目前,較為常用的供體-受體分子對,主要有綠色熒光蛋白類(GFPs)和染料類。綠色熒光蛋白類有CFP-YFP,BFP-GFP,BFP-YFP 等,染料類的有 Cy3-Cy5,F(xiàn)ITC-Rhodamine 等。且這些熒光物質(zhì)要能夠標記在研究對象上。
應(yīng)用要求
供體熒光基團和受體熒光基團的空間距離要<10nm; 供體的發(fā)射光譜與受體的接收光譜有相當?shù)闹丿B;
供體、受體分子在量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、水溶性、抗干擾能力等方面要求較高。
優(yōu)缺點
優(yōu)點 | 缺點 |
在活細胞的正常生理條件下進行檢測,觀察大分子在細 胞內(nèi)的構(gòu)象變化與相互作用,并彌補了需破碎細胞檢測 相互作用的缺點;靈敏度高,可實現(xiàn)對單細胞水平的研究,研究單個受體 分子;可與多種儀器和技術(shù)結(jié)合使用,如顯微鏡,色譜技術(shù),電泳,流失細胞技術(shù)等; | 應(yīng)用比較局限,一般需要在待檢測分子上偶聯(lián)熒光物質(zhì)(加上記); |
應(yīng)用
細胞內(nèi)分子間的相互作用
膜蛋白的研究
細胞膜受體蛋白間的相互作用
細胞凋亡的研究
核酸檢測
實驗流程簡述
以熒光物質(zhì) CFP(供體)-YFP(受體)為例,檢測 AB 蛋白在細胞內(nèi)的相互作用。
1.細胞培養(yǎng):根據(jù)實驗培養(yǎng)特定的細胞用于轉(zhuǎn)染,觀察檢測分子在細胞內(nèi)的相互作用;
2.細胞轉(zhuǎn)染:構(gòu)建質(zhì)粒載體 CFP-A 和 YFP-B,將檢測的 AB 蛋白分別偶聯(lián)上熒光蛋白 CFP 和 YFP,并將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細胞內(nèi);
3.檢測 FRET:質(zhì)粒載體 CFP-A 和 YFP-B 轉(zhuǎn)染細胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢測,是否發(fā)生 Fret;
4.FRET 圖像采集: 確定 FRET 配對的激發(fā)波長, 藍光被調(diào)諧分別用于探測最大和最小的供體和受體信號, 最大供體信號和最小受體信號對應(yīng)的波長用于收集雙表達細胞的 FRET 信號。調(diào)整激光變化,以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP 信號的激發(fā)光波長,采集供體和受體圖像,收集 FRET 信號。每個細胞 FRET 檢測重復 3 次,每種轉(zhuǎn)染至少完成 6 個細胞的 FRET 檢測;
5.FRET 數(shù)據(jù)處理: 去除 FRET 信號中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號; 受體通路的 FRET 信號需要對
供體受體光譜靈敏度的變化進行矯正、對自發(fā)熒光和光學噪聲進行矯正; 利用矯正系數(shù)對雙標定細胞進行象素匹配矯正。