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蛋白表達資料

原核蛋白表達

大腸桿菌表達系統(tǒng)

 

大腸桿菌蛋白表達原理

誘導原理:Lac 阻遏物是一種具有 4 個相同亞基的四級結構蛋白,都有一個與誘導劑結合的位點。在沒有乳糖存在時,lac 操縱子(元)處于阻遏狀態(tài),Lac 阻遏物能與操縱基因 O 結合,阻礙 RNA 聚合酶與 P 序列結合,抑制轉錄起動。而當有誘導劑與阻遏蛋白結合后,其蛋白構象就發(fā)生變化,導致阻遏物從操縱基因 O 上解離下來,RNA 聚合酶不再受阻礙,發(fā)生轉錄。
 

大腸桿菌表達系統(tǒng)步驟

不包括基因構建等上游操作和蛋白純化部分?;驑嫿▍⒖济艽a子優(yōu)化,蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內(nèi)容主      要包括蛋白表達鑒定:

1.表達鑒定第一天的任務,常用抗性選擇根據(jù)感受態(tài)細胞選擇

  • 拿到質(zhì)粒,離心(3000r/min;2min)

  • 在質(zhì)粒中加入 TE(使質(zhì)粒最終加入到 110μL 感受態(tài)細胞中的量為 80-100ng,據(jù)此確定加入 TE 的量

  • 一般為(1μg 質(zhì)粒加 20μLTE;2μg 質(zhì)粒加 50μLTE;5μg 質(zhì)粒加 100μL TE)

  • 將質(zhì)粒與 TE 混勻,加入 2μL 混液于感受態(tài)細胞中

  • 將感受態(tài)細胞放入冰箱(4℃)中,30min

  • 取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激 90s,

  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min

  • 拿出后取 200μL 的 LB 液體培養(yǎng)基加入到已轉入質(zhì)粒的感受態(tài)細胞中

  • 放入搖床(37℃; 195r) 中, 30nim 至 60min; 最佳 45min)

  • 取出離心(3000r/min;2min)

  • 去掉 200μL 的上清,留 100μL 左右上清懸浮沉淀,吸取 50μL 懸液涂平板,先將對應抗性的平板放入培養(yǎng)箱(37℃)中預熱 20min)

  • 把平板放入培養(yǎng)箱(37℃),過夜(12h 至 16h)

2.表達鑒定第二天的任務,注意 Pcold 的表達溫度

  • 每個平板挑取單菌落至 4 支對應抗性的 LB(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”

  • 將試管放入搖床(37℃;195r) 中,單抗 3h 左右;雙抗 4 左右;剛開始用可見分光光度計測 OD 值; 熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)),測 OD 值(0.6 至 0.8)

  • 從“0”號管中取 700μL 懸液加入到 100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存

  • 在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入 2μL 的 IPTG(終濃度 0.5mM 最適

  • 視不同的載體選擇適合的表達環(huán)境(PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達 6h;37℃表達 3h 至 4h(4 支試管,“0”“1”號試管 15℃表達過夜;“2”“3”試管 37℃表達 3h 至 4h)。Pcold:全部 15℃表達過夜)

3.表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度

  • 從每組 4 支的試管中均取 500μL 菌液加入到 1.5ml 離心管中,若 OD 值不一樣,值小的可多取離心

  • (6000r/min),5min, 去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近)

  • 在每個離心管中加入 500μL 的 DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀

  • 在每支離心管中加入 45μL 的 1×PBS 和 45μL 的 2×Loading Buffer 懸浮沉淀(當溶質(zhì)適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質(zhì)多且粘稠時,應使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量)

  • 放入煮樣器(100℃) 25min

  • 取出后離心(6000r/min) 3min, 電泳檢測。

 

大腸桿菌表達系統(tǒng)

  • 質(zhì)粒載體:小型環(huán)狀 DNA,能自我復制。一個完整的質(zhì)粒載體必須要有復制起點、啟動子、插入的目的基因、篩選標記以及終止子;此外對大腸桿菌表達載體的要求是:①操縱子以及相應的的調(diào)控序列,外源基因產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有毒害作用;②SD 序列,即核糖體識別序列,一般 SD 序列與起始密碼子之間間隔 7-13bp 翻譯效率最高;③多克隆位點以便目的基因插入到適合位置。

  • 目的基因:在大腸桿菌表達體系中要表達的基因即外源基因,包括原核基因和真核基因;原核基因可以在大腸桿菌中直接表達出來,但是真核基因韓有內(nèi)含子不能,大腸桿菌不能對 mRNA 進行剪切,從而形成成熟的 mRNA,所以真核基因一般以 cDNA 的形式在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達。此外還需提供大腸桿菌能識別的且能轉錄翻譯真核基因的元件。

  • 表達宿主菌:表達蛋白的生物體即大腸桿菌。表達宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達過程中是很重要的因素——多數(shù)人會直接選擇實驗室曾經(jīng)用過的宿主菌,而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據(jù)宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性,例如目的蛋白需要形成二硫鍵,可以選擇 Origami 2 系列,Origami 能顯著提高細胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率,促進蛋白可溶性及活性表達;目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta 2 系列,補充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及 CGG)稀有密碼子對應的 tRNA,提高外源基因的表達水平。

  •  

    大腸桿菌表達現(xiàn)象

    可能原因

    建議宿主

    無蛋白表達或出現(xiàn)截短蛋白

    密碼子偏移性

    Rosetta 2

    Rosetta gami 2

    Rosetta gami B
    RosettaBlue

    pLysS 菌株

    rigami 2

    Rosetta gami 2Rosetta gami B
    pLysS、pLysE 菌株

    細胞死亡,生長極困難

    基因產(chǎn)物為毒性蛋白

    蛋白無活性

    蛋白錯誤折疊



    無克隆生長



    過高本底表達

    • 大腸桿菌表達系統(tǒng)種類

    • T7 大腸桿菌表達系統(tǒng)

    以 T7 啟動子、T7RNA 聚合酶等 T7 噬箘體轉錄體系的元件為核心構建的表達系統(tǒng)。T7 RNA 聚合酶一種高活性的RNA 聚合酶,mRNA 的合成速度比大腸桿菌內(nèi)的 RNA 聚合酶快 5 倍,并某些不能被大腸桿菌 RNA 聚合酶轉錄的序列也可以轉錄,所以 T7 RNA 聚合酶和 T7 噬箘體啟動子的存在的情況下,大腸桿菌本身的轉錄競爭不過 T7 噬箘體轉錄體系,最終受 T7 噬箘體啟動子控制基因的轉錄。

    •  

    • Lac 和 Tac 大腸桿菌表達系統(tǒng)

    它是以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機理為基礎設計、構建的大腸桿菌表達系統(tǒng),具有多順反子結構,結構排列為:

    •  

    • 啟動子(lacP)- 操縱基因(lacO) - 結構基因(lacZ-lacY-lacA)
      原理:在無誘導物的情況下,負調(diào)節(jié)因子 lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白與啟動子下游的操縱基因緊密結合,阻止轉錄的起始。加入誘導劑后,IPTG 與 lacI 基因產(chǎn)物結合,使操縱基因解離出來,lac 操縱子的轉錄因此被激活。用 tac 啟動子構建的表達系統(tǒng)稱為 Tac 表達系統(tǒng)。
       

    • PL 和 PR 大腸桿菌表達系統(tǒng)

    以啟動子 PL、PR 為核心構建的表達系統(tǒng)。PL 和 PR 表達系統(tǒng)具有很強的啟動轉錄能力,誘導時不需要加入化學誘導劑,成本低廉,但在熱刺激過程中,大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會被激活,降解所表達的外源蛋白;其次是在      大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)菌體時,通過熱平衡交換方式提高溫度,需要較長的時間,這會降低誘導效果,從而對重組蛋白的表達量有影響。


    此外還有其他表達系統(tǒng),如 pH 調(diào)控型、營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型等。

    大腸桿菌表達系統(tǒng)比較

    種類

    優(yōu)點

    缺點

    T7 大腸桿菌表達系統(tǒng)

    目的基因的表達水平高

    較高的本底表達
    對表達和制備用于醫(yī)療的重組蛋白不適合

    對表達和制備用于醫(yī)療的重組蛋白不適合
    可能降解所表達的重組蛋白,不適合大規(guī)模培養(yǎng)

    Lac 表達系統(tǒng)

    易于調(diào)控和操作

    Tac 表達系統(tǒng)

    易于調(diào)控,轉錄水平高于 lac

    PL  PR 表達系統(tǒng)

    不需要加入化學誘導劑,成本又低廉,轉錄能力強

    大腸桿菌與其他表達系統(tǒng)比較

    種類

    優(yōu)點

    缺點

    大腸桿菌表達系統(tǒng)

    大腸桿菌表達系統(tǒng)具有表達背景清楚,表達水平高, 操作簡單,培養(yǎng)周期短,抗污染能力強

    表達真核基因只能用其 cDNA,不能進行翻譯后的修飾加工,含有大量內(nèi)毒素

    哺乳動物表達系統(tǒng)

     

    可以使蛋白正確折疊,提供復雜的 N 型糖基化和準確的 O 型糖基化等加工修飾,更接近于天然蛋白

    產(chǎn)率低,某些糖基化產(chǎn)物不穩(wěn)定、不易純化,費用昂貴

     

    酵母表達系統(tǒng)

    使用簡單,表達量高,可大規(guī)模生產(chǎn),與原核相比 可對異源蛋白修飾

    酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題。

     

    昆蟲表達系統(tǒng)

    使用簡單,表達量高,可大規(guī)模生產(chǎn),與原核相比 可對異源蛋白修飾

    外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的 調(diào)控之下,由于病毒感染,細胞開始死亡, 無法進行連續(xù)性表達