LSPR技術
技術指南：COOH傳感器與胺偶聯(lián)試劑盒
1、概述
在COOH傳感器芯片表面上具有均勻的的羧基層。這些羧基能夠被標準EDC/NHS化學物激活并通過氨基化學偶聯(lián)配體 （圖1）。Nicoya胺基偶聯(lián)試劑盒中包含所有完成該偶聯(lián)所需的試劑而且試劑盒已被優(yōu)化為最佳性能。這種耦聯(lián)方法使得配體穩(wěn)定的附著于表面，并且結合的相互作用可以很容易在OpenSPR儀器上測量。
共價偶聯(lián)
2、實驗需要的試劑及儀器
● COOH傳感器芯片：儲存在2-8°C
● NHS：儲存在2-8°C，一旦稀釋分裝，儲存在–20°C
● EDC：儲存在2-8°C，一旦稀釋分裝，儲存在–20°C
● 激活緩沖液：儲存在2-8°C
● 封閉液：儲存在2-8°C
● 運行緩沖液：1X PBS pH 7.4（需要老師配）
● 80%的IPA （異丙醇）（需要老師提供）
● 去離子水（需要老師提供）
● 瞬時離心機（需要老師提供）
● 移液槍及槍頭（1ml，200ul，100ul）（需要老師提供）
● 配體（固定到芯片）：蛋白純度高于90%，濃度（30-100ug/ml），體積大于200ul
● 分析物：蛋白或大分子濃度（30-100ug/ml），體積大于200ul，小分子（溶于DMSO的）要求濃度大于100uM 或30mg/ml
● 再生緩沖液100mM的HCL，或1%的SDS
EDC分裝準備
1）將EDC溶解于1mL活化緩沖液中
2）用移液器分裝成10個100μL，儲存在–20°C.
NHS 分裝準備
1）將NHS溶解于1mL活化緩沖液中
2）用移液器分裝成10個100μL，儲存在–20°C.
注：試劑必須從分裝瓶里現(xiàn)取現(xiàn)用，且在使用前混合。EDC / NHS酯的半衰期較短，因此配體激活后立刻上樣。此外，蛋白質長時間在低pH值下通常不穩(wěn)定，所以配體稀釋到激活緩沖液后要立即注入。
再生緩沖液參考：
1. Acid 5-150 mM | 2. SDS 0.01 – 0.5% |
Proteins | Peptides |
Antibodies | Proteins/Nucleic acids |
3. NaoH 10 mM | 4. IPA:HCl 1:1 |
Nucleic acids/Nucleic acids | ■Lipids |
緩沖條件
通常將大的配體如蛋白質固定在COOH傳感器芯片上的方法預富集。預富集是利用靜電力在傳感器的表面增加配體的局部濃度的技術。Nicoya為預富集提供了優(yōu)化的激活緩沖液與胺偶聯(lián)試劑盒。不能被預富集的配體，需要通過其他方法固定，如通過組氨酸標簽捕獲偶聯(lián)。
注意，緩沖液中胺組或強親核試劑如Tris或疊氮化鈉應避免與胺基耦聯(lián)，因為這些基團將與配體競爭。
如果胺基耦聯(lián)試劑盒不能達到足夠的固定水平，可嘗試增加的配體的濃度。如果它仍然不夠，則需要進一步優(yōu)化激活緩沖液。
3、COOH傳感器芯片實驗步驟：
注–本程序假設儀器中使用的是100μL的樣品環(huán)。如果要安裝更大的樣品環(huán)，則需要重新調整體積。
1）按照標準程序，在OpenSPR儀器上安裝羧基傳感器芯片。
2）開始以最大流速運行緩沖液（ex.1X PBS pH 7.4）。
3）在達到信號基線后，從上樣口注入80%的IPA，將控制閥轉到inject，運行10s轉回到load進行排氣泡，達到基線后，緩沖液沖洗樣本環(huán)，并用空氣排空。
4）注入10mM的Hcl 清洗芯片表面，運行1min（芯片第一次用時需要此步驟）
5）減慢緩沖液流速至20μl/min。
6）解凍并立即混合1等分的EDC和NHS，注入到儀器中。與傳感器相互作用5分鐘。一旦相互作用結束，用緩沖液沖洗上樣口并用空氣排空。
7）用激活緩沖液稀釋用于固定的配體， 體積為200μL濃度為10-50μg/mL。稀釋后立即將配體注入儀器（相互作用5分鐘 ）。在EDC / NHS完成抽吸后，這步需要快速連續(xù)的進行。用緩沖液沖洗上樣口并用空氣排空。
單位換算：10ug/ml=10mg/L=[10mg/MW/mol)]/L=?mM/L = ?uM/L)
8）注入250μL封閉液（互相作用5分鐘 ）。一旦封閉液已經通過，傳感器就可準備用于測量分析物和配體之間的結合相互作用。沖洗和清除樣品回路。
9）通過比較EDC/NHS活化前與閉鎖后的信號，測量配體結合量。在圖2所示的示例中，它是約700pm。
10)如有已知的再生緩沖液條件，將泵的速度提高到150ul/min，注入再生緩沖液初始化配體表面。
11）將泵速調到20ul/min,注入高濃度的分析物以確認配體的活性，并確認表面的近似的最大結合能力。清洗及排空樣本環(huán)。
12）提高泵速到150μL/min，準備適當?shù)脑偕彌_液和裝載250μL并注入以去除分析物。芯片表面即可用于分析物動力學分析。
如下圖所示的例子。
圖2 COOH傳感器芯片配體的制備
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