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離子交換色譜的原理介紹和實際操作

       離子交換色譜是蛋白純化技術(shù)中常用的一種純化方法，其原理是指  被分離物質(zhì)所帶的電荷可與離子交換劑所帶的相反電荷結(jié)合，這種  帶電分子與固定相之間的結(jié)合作用是可逆的，在改變 pH 或者用逐漸增加離子強度的緩沖液洗脫時，離子交換劑上結(jié)合的物質(zhì)可與洗  脫液中的離子發(fā)生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質(zhì)的電荷不  同，其與離子交換劑的結(jié)合能力也不同，所以被洗脫到溶液中的順  序也不同，從而被分離出來。
       離子交換劑是由不溶于水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子聚合物骨架構(gòu)成，骨架  上有許多共價結(jié)合的帶電基團，如果側(cè)鏈?zhǔn)菐д娀鶊F，就可與帶
       負(fù)離子相結(jié)合，稱為陰離子交換劑，吸附帶負(fù)電蛋白質(zhì)。如果側(cè)鏈?zhǔn)菐ж?fù)電的基團，則稱為陽離子交換劑。強離子      交換樹脂在寬 pH 范圍內(nèi)保持離子化，而弱離子交換樹脂只在窄 pH 值內(nèi)離子化。

       絕大多數(shù)重組蛋白純化都要用到離子交換。離子交換色譜的基礎(chǔ)是高分辨率，可以直接放大規(guī)模應(yīng)用在工業(yè)上，柱      再生容易，還可以使蛋白濃縮。大多數(shù)蛋白質(zhì)的靜電荷是負(fù)值，因此陰離子交換色譜的應(yīng)用最為廣泛。
實驗設(shè)計

介質(zhì)的選擇
       離子交換介質(zhì)首先要考慮目的分子的大小，因為目的分子會影響其接近介質(zhì)上的帶電功能集團，因此也會影響介質(zhì)      對目的分子的動力載量，從而影響其分離。
       對于大多數(shù)純化步驟來說，建議從開始的階段使用強離子交換柱，可在摸索方法的過程中有一個寬的 pH 范圍。對于已知等電點的蛋白質(zhì)，可根據(jù)其等電點來選擇。而未知等電點的蛋白質(zhì)，在實際操作中常采用這樣的方法，先選      擇一個陰離子交換劑，再選擇一個中性的 pH 緩沖液，將蛋白質(zhì)樣品透析至 pH7.0，然后過陰離子交換柱。根據(jù)過柱后的結(jié)果確定下一個使用的緩沖液 pH。

流動相的選擇
       離子交換色譜的流動相必需是有一定離子強度的并對 pH 有一定緩沖能力的溶液。為了避免目的蛋白失活，使用緩沖液可穩(wěn)定流動相的 pH，使之在色譜過程中不發(fā)生明顯變化，同時可穩(wěn)定目的分子上的電荷量，保證色譜結(jié)果的重要性。
       選擇緩沖液一般按照以下原則：陽離子交換劑應(yīng)選用陰離子緩沖液，可用檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸鹽等； 陰離子交換劑應(yīng)選用陽離子緩沖液，可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等；起始緩沖液的濃度應(yīng)盡可能低（<100mmol/L）這樣可以使色譜柱上更多的吸附分離物質(zhì)；緩沖液應(yīng)不含會影響被分離物質(zhì)活性和溶解度成分，洗脫時盡量不采用 pH 梯度洗脫。

色譜柱的選擇
       離子交換色譜通常選用粗短柱，即高徑比小的色譜柱。典型的離子交換柱高度在 5~20cm，高徑比一般小于 5。如果需要增加離子交換劑的體積，只能從增加柱的直徑而不能增加其高度。如果是連續(xù)梯度洗脫，可以適當(dāng)增加柱的      長度。

案例介紹
離子交換是蛋白純化中的重要手段，即可以用于捕獲階段，也可以用于精純階段。

預(yù)處理和裝柱
1.將超純水與沉降膠按 1:3 比例懸浮，輕輕攪勻；
2.將色譜柱固定到設(shè)備支架上，鏈接出口管道，從柱底端進口反向泵入超純水，排除管道及篩板中的氣泡，停泵，      然后從出口端放出部分超純水，保留 1~2cm 高度超純水，封死出口端，然后正向沖洗進口端管道和適配器， 排除篩板和管道中氣泡；
3.通過玻璃棒引流將懸浮膠導(dǎo)入色譜柱，在柱上端補充部分超純水，攪勻，裝上適配器；
4.將柱出口端與色譜設(shè)備連接，以 0.2MPa 恒壓裝柱，裝填至恒定的柱床高度，標(biāo)記柱床膠面位置，關(guān)閉泵，松開適配器，降低適配器至膠面下 2mm 處，繼續(xù)裝填，待柱床高度穩(wěn)定后，標(biāo)記柱床膠面位置，降低適配器至柱上標(biāo)記柱床位置下 2mm。固定適配器，繼續(xù)裝填 2~3 柱體積；
5.確定柱體積，測量柱高，計算柱體積及記錄裝柱時的最大流速；
6.選擇最佳線速，用 0.5mol/L NaOH 沖洗柱，沖洗 3~5 體積；
7.接著用超純水沖柱，沖洗 10 柱體積，至 pH 顯示接近超純水 pH。

柱的平衡
20mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH6.5，用 10 柱體積平衡緩沖液平衡柱子，直至 pH 及電導(dǎo)率監(jiān)控顯示與平衡緩沖液的 pH 及電導(dǎo)一致。
加樣
根據(jù)柱體積及裝柱的最大流速確定上樣流速，上樣流速不超過裝柱最大流速的 75%，同時，上樣流速也要盡可能低， 保證樣品和介質(zhì)充分發(fā)生作用。
洗脫
上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液沖洗 1~2 柱體積，使 UV280 響應(yīng)信號重新回到基線。之后用含有 0.5mol/L NaCL 的溶液洗脫，沖洗 2~3 柱體積，收集色譜峰。

常見問題分析
一、純化后樣品純度不高怎么辦？
1. 若目標(biāo)蛋白和雜蛋白等電點差異較大，目標(biāo)蛋白通過穿透步驟獲得，通過調(diào)節(jié)起始緩沖液 pH，使目標(biāo)蛋白與填料之間的靜電作用更強；
若目標(biāo)蛋白和雜蛋白等電點差異較小，目標(biāo)蛋白通過洗脫步驟獲得，過調(diào)節(jié)起始緩沖液 pH，使目標(biāo)蛋白與填料之間的靜電作用更強；再調(diào)節(jié)洗脫溶液的離子強度和 pH，使目標(biāo)蛋白與雜蛋白逐漸分離；

選擇合適的離子交換填料及粒徑； 柱沒有經(jīng)過起始緩沖液的充分平衡； 降低洗脫流速；
調(diào)整樣品溶液黏度。
二、純化后的蛋白收率較低怎么辦？
調(diào)整樣品 pH，使樣品 pH 與起始緩沖液 pH 保持一致；
改變洗脫模式，如將線性梯度模式改變?yōu)殡A段性梯度洗脫；  改變洗脫方法，如將 pH 洗脫方法改為鹽梯度洗脫方法； 改變洗脫強度。
三、樣品過于粘稠怎么處理？
樣品過于粘稠可能是由于含有的蛋白太多，或者含有大分子量的核酸分子，通常有以下解決方法：     增加裂解前稀釋細(xì)胞所用體積；
增加裂解時間，直至黏度下降，或者增加 DNase 和 Mg2+的劑量； 增加機械裂解細(xì)胞的效率；
降低上樣流速。