細胞株是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)細胞。從培養(yǎng)代數(shù)來講，可培養(yǎng)到40-50代。且細胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。對于人類腫瘤細胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。

將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進行篩選，篩選來得到可穩(wěn)定表達目的蛋白，或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。

最常用的真核表達載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)。

多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光通常強弱夾雜，從感染72小時后開始加入篩選藥物，每隔2天重新?lián)Q液加入篩選藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察到的熒光細胞比例為100%。

穩(wěn)定表達細胞株主要應(yīng)用于以下研究中：

1、需要長期在目的細胞中研究基因功能。通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便長期的實驗研究；

2、部分蛋白半衰期及長，瞬時RNA只能干擾表達，無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實驗更好的基因干擾效果；

3、瞬轉(zhuǎn)會引入不可預(yù)期的拷貝數(shù)表達（往往瞬時表達較高），導(dǎo)致因為人為因素造成實驗結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究；

4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的實驗，用于控制基因的時空表達；

5、需要用目的細胞構(gòu)建動物模型的實驗，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。

慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達，因此，慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達/沉默特定基因的單克隆細胞株。

如何用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株：

1、目的細胞的合適抗生素濃度篩選；

2、目的細胞的合適病毒滴度篩選；

3、慢病毒構(gòu)建與包裝與滴度測定；

4、慢病毒感染；

5、特定抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；

6、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株鑒定。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建是一個長時間多平臺合作的項目，有多種因素容易導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建失敗，你都遇到過哪些情況呢？