產(chǎn)品英文名（Product Name）

FITC Annexin V/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品描述（Description）

細(xì)胞凋亡是胚胎發(fā)育和為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡的一種正常生理過程。它是細(xì)胞正常生理活動(dòng)的一部分，包括細(xì)胞膜不對(duì)稱性和附著性喪失、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)濃縮、核小體間DNA斷裂。細(xì)胞膜的破壞是細(xì)胞凋亡的早期特征。在正常細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞膜中的磷酯酰絲氨酸（PS）由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，從而將PS暴露于細(xì)胞外部環(huán)境。Annexin V是一種35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合。因此，Annexin V被公認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

碘化丙啶（Propidium， PI）是一種核酸染料，PI不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可穿透膜損傷的細(xì)胞如晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，使細(xì)胞核著染上紅色。因此，將Annexin V與PI共染，則可以區(qū)分不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。本公司生產(chǎn)的細(xì)胞凋亡試劑盒將Annexin V以綠色熒光FITC進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的Annexin V保留了與PS的高親和力，可作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡檢測(cè)。聯(lián)合可檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡或死細(xì)胞的紅色核酸染料PI則可以很好的將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞核死細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。在雙色流式細(xì)胞散點(diǎn)圖上，Annexin V-FITC與PI雙陰性為正常細(xì)胞群，Annexin V-FITC陽(yáng)性、PI陰性為早期凋亡細(xì)胞群，Annexin V-FITC與PI雙陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞群。

儲(chǔ)存條件（Storage）

2-8℃避光保存

運(yùn)輸方式（Shipping）

冰袋運(yùn)輸

使用方法（Standard Operating Procedure）icon

1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）1x磷酸緩沖液PBS；

（2）凋亡誘導(dǎo)劑；

（3）去離子水；

2.樣品預(yù)處理

2.1 樣品染色

（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對(duì)照。此外，進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí)需取實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行Annexin V-FITC和PI單染，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

（2）收集細(xì)胞。

  懸浮細(xì)胞：1000rpm、4℃離心5min，棄培養(yǎng)基上清；

  貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集，1000rpm、4℃離心5min，棄上清；

（3）洗滌細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均在1000rpm、4℃離心5min，棄上清；

（4）配制1x Annexin V-binding buffer。用去離子水按照1:5體積比稀釋5xAnnexin V-binding buffer備用；

（5）細(xì)胞重懸。加入100 μl 1x Annexin V-binding buffer，輕輕吹勻至單細(xì)胞懸液；

（6）細(xì)胞染色。加入5 μl Annexin V和5 μl PI Staining Solution，輕輕吹勻，置于室溫避光孵育5-10min，再加入400 μl 1x Annexin V-binding buffer，輕輕混勻重懸。在1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析或熒光顯微鏡觀察分析。 

2.2 樣品分析

2.2.1 熒光顯微鏡分析

（1）將已染色重懸的細(xì)胞滴一滴在載破片上，并用蓋破片蓋上細(xì)胞；

  針對(duì)貼壁細(xì)胞可以直接接爬片讓細(xì)胞直接生長(zhǎng)在爬片上進(jìn)行誘導(dǎo)及染色處理；

（2）置于熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察：Annexin-V-FITC熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)呈紅色。

2.2.2 流式細(xì)胞儀分析

（1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光采集通道FL1通道檢測(cè)；PI的紅色熒光采集通道PI通道或FL2或FL3通道檢測(cè)，建議使用FL3通道，每個(gè)樣本采集10000個(gè)事件；

（2）熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除廣譜重疊與設(shè)定十字門的位置。在雙色流式細(xì)胞散點(diǎn)圖上，Annexin V-FITC與PI雙陰性為正常細(xì)胞群，Annexin V-FITC陽(yáng)性、PI陰性為早期凋亡細(xì)胞群，Annexin V-FITC與PI雙陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞群。

3. 應(yīng)用案例（流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)喜樹堿誘導(dǎo)Jurakt細(xì)胞凋亡）

分別用2.0、10 μM喜樹堿（Camptothecin， CPT）誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞（人T淋巴瘤細(xì)胞株）4h收集細(xì)胞進(jìn)行流式凋亡檢測(cè)。參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行相關(guān)染色操作并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)，結(jié)果如下圖。

（A）0μM對(duì)照組. （B）2.0μM實(shí)驗(yàn)組. （C）10μM實(shí)驗(yàn)組. 其中

產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)圖片icon

組分&說明（Component & Instruction）icon