酸性小分子蛋白-鈣調蛋白(CaM)是鈣離子感受器和許多酶的控制元件，包括一氧化氮合酶(NOS)，這些酶在關鍵的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。CaM結合引起NOS的構象變化，從而允許還原酶和氧合酶域之間的電子轉移，這一過程被認為是高度動態(tài)的。NOS酶中的電子流發(fā)生于NADPH，通過FAD和FMN輔因子到血紅素氧合酶域。最近利用脈沖電子-電子雙共振(PELDOR)光譜、單分子熒光共振能量轉移(FRET)光譜和電子冷凍顯微鏡(EM)的研究，更好地了解了CaM激活NOS的機制。這些研究表明NOS酶包含一個二聚氧酶結構域，該結構域作為整個酶分子的錨定二聚體結構。兩側有兩個分離的還原酶結構域，存在于FAD-FMN電子轉移(輸入狀態(tài))和FMN -血紅素電子轉移(輸出狀態(tài))之間的構象平衡中，與CaM結合誘導構象平衡的改變，從而允許NOS酶中的有效電子轉移。
當CaM與NOS完全結合時，CaM的氨基端小葉殘基與NOS的FMN子結構域相互作用并形成橋接相互作用，這似乎是控制FMN與血紅素相互作用所必需的。CaM通過穩(wěn)定和精確定位FMN子域，使電子從FMN穿梭到氧合酶域，從而激活NOS。 2016年10月4日，Michael Piazza 在Biochemistry發(fā)表了《Structural Studies of a Complex Between Endothelial Nitric Oxide Synthase and Calmodulin at Physiological Calcium Concentration》, 這篇報道使用核磁共振波譜來確定內皮型一氧化氮合酶(eNOS)肽與CaM在最低Ca2+濃度(225 nM)下的復合物的溶液結構，這是CaM與eNOS結合所需的最低Ca2+濃度，對應于哺乳動物細胞中發(fā)現的生理上升高的Ca2+水平。在這些條件下，CaM-eNOS復合物有一個與eNOS肽結合的鈣離子豐富的羧基端小葉和一個與eNOS肽松散結合的鈣離子游離的氨基端小葉。隨著Ca2+濃度的增加，CaM 氨基端小葉與Ca2+的結合導致與eNOS肽羧基端區(qū)域的相互作用增強，并增加了肽的α-螺旋結構，這可能是導致電子從FMN轉移到酶加氧酶域的血紅素的機制的一部分。在相同條件下進行的SPR研究表明，Ca2+濃度依賴性結合動力學與NMR結構結果一致。表面等離子共振顯示Ca2+濃度的增加穩(wěn)定CaM-eNOS復合物。采用SPR進一步分析eNOS肽與CaM在225 nM Ca2+上的相互作用。SPR分析使我們能夠使用非標記系統來確定蛋白質與肽的結合動力學。這種結合相互作用的動力學，包括結合親和力，結合和解離率，通過在固定的eNOS肽表面注射不同濃度的CaM來確定。在0.1 mM的飽和Ca2+濃度下獲得不同CaM濃度(10到500 nM)的傳感器圖，以確保Ca2+充足的CaM與eNOS肽的最佳相互作用。
表：在225 nM Ca2+和sat Ca2+條件下，eNOS靶肽與CaM的 kon速率常數和koff速率常數
圖：各種CaM構建體和eNOS肽在飽和Ca2+ (0.1 mM CaCl2)和225 nM游離Ca2+時的KD和koff比較
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