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等溫滴定量熱(ITC)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

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通過測(cè)量結(jié)合過程中的熱傳遞,就能夠準(zhǔn)確地確定結(jié)合常數(shù) (KD)、反應(yīng)化學(xué)量 (n)、焓 (?H) 和熵 (ΔS)。這就提供了有關(guān)分子相互作用的完整熱力學(xué)信息。ITC 不僅可測(cè)定結(jié)合親和力,還能闡明潛在分子相互作用的機(jī)制。


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測(cè)量原理   


等溫滴定量熱法用來測(cè)定各生物分子之間的反應(yīng)。該方法可測(cè)定結(jié)合親和力、化學(xué)計(jì)量以及溶液中結(jié)合反應(yīng)的熵和焓,無(wú)需使用標(biāo)記。發(fā)生結(jié)合時(shí),熱不是被吸收就是被釋放,這是在配體被逐漸滴定到包含目標(biāo)生物分子的樣品池過程中通過靈敏量熱計(jì)而測(cè)得。

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圖為原理示意

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工作原理    


熱核心


微量熱計(jì)中有兩個(gè)池,其中一個(gè)含有水,作為參比池,另一個(gè)含有樣品。微量熱計(jì)必須使這兩個(gè)池保持完全相同的溫度。熱敏裝置檢測(cè)發(fā)生結(jié)合時(shí)兩個(gè)池之間的溫差,并反饋給加熱器,由加熱器來補(bǔ)償該溫差并使兩個(gè)池恢復(fù)到相同的溫度。

進(jìn)行測(cè)量


參比池和樣品池被設(shè)定到所需的實(shí)驗(yàn)溫度。將配體裝入一個(gè)非常精確的注射裝置上的注射器中。將注射裝置插入包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品池中。將一系列小份配體試樣注入到蛋白質(zhì)溶液中。如果有配體與蛋白質(zhì)結(jié)合,則可檢測(cè)到并測(cè)出幾百萬(wàn)分之一攝氏度的熱量變化。進(jìn)行第一次注射時(shí),微量熱計(jì)測(cè)量被釋放的所有熱量,直到結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡。  測(cè)得的熱量與結(jié)合量成正比。


結(jié)果和數(shù)據(jù)分析


在下面的示例中,反應(yīng)是放熱的,這就意味著樣品池溫度高于參比池并由此導(dǎo)致信號(hào)出現(xiàn)下行波峰。隨著兩個(gè)池的溫度恢復(fù)到同一水平,信號(hào)也回到其起點(diǎn)。將第二小份配體試樣注入到樣品池中,同樣,微量熱計(jì)補(bǔ)償所檢測(cè)到小幅熱量變化。配體與蛋白質(zhì)之間的摩爾比隨著一系列配體試樣的注入而逐漸增加。蛋白質(zhì)越來越飽和,配體結(jié)合的次數(shù)越來越少,并且熱量變化開始減小,直到樣品池中的配體數(shù)量相對(duì)于蛋白質(zhì)而言最終表現(xiàn)出過量為止,從而使反應(yīng)朝飽和的方向進(jìn)行。

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圖為原理示意


然后對(duì)每個(gè)峰的面積進(jìn)行積分,并以配體與蛋白質(zhì)的摩爾比作為橫坐標(biāo)進(jìn)行繪圖。由此得出的等溫線可擬合至導(dǎo)出親和力 (KD) 的結(jié)合模型。結(jié)合等溫線中心的摩爾比即為反應(yīng)化學(xué)計(jì)量。下圖給出了 1:1 結(jié)合反應(yīng)的示例圖。

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焓 (ΔH) 也可通過等溫線直接導(dǎo)出,它表示每摩爾結(jié)合配體所釋放的熱量。這就意味著一次 ITC 實(shí)驗(yàn)就可提供豐富的結(jié)合反應(yīng)信息,有助于理解相互作用的性質(zhì)并探索熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)因素。

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寫在后面


ITC 廣泛用于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的以下方面:


量化結(jié)合親和力

候選藥物的選擇與優(yōu)化

測(cè)定熱力學(xué)特性和活性濃度

作用機(jī)制表征

在小分子藥物發(fā)現(xiàn)過程中確認(rèn)預(yù)期結(jié)合靶標(biāo)

測(cè)定結(jié)合特異性和化學(xué)計(jì)量

驗(yàn)證從苗頭化合物到先導(dǎo)化合物演化過程中的 IC50 值和 EC50 值

酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定

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